宫腔注射PBMCs改善小鼠胚泡着床障碍及其机制初探*

余 楠 李 伟 林星光 陈素华 冯 玲 邓东锐 曾万江 乌剑利

胚胎着床障碍已成为胚胎学家和临床生殖医学关注和研究的课题之一[1]。研究表明着床障碍病因很复杂，可能与内分泌异常、免疫失衡和子宫内膜容受性有关，且无确切有效的治疗方法[2]。值得期待的是近年来免疫学治疗研究获得良好进展，可以显著提高患者的妊娠率和着床率[1,2]，包括我们前期的研究给予患者自体外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)宫腔注射，使其临床妊娠率达到46.24%，分析原因可能与PBMCs能促进滋养细胞侵入子宫内膜，改善免疫微环境等有关[3]，但具体机制不明。本次实验通过复制小鼠着床障碍模型，经宫腔注射PBMCs治疗，观察胚泡着床率变化及其与子宫内膜血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)及整合素β3表达水平的关系，为不孕症胚胎着床障碍的机制研究进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物：SPF级性成熟昆明雌性小鼠85只和雄性小鼠20只购自并饲养于华中科技大学同济医院实验动物中心，6-8周龄，体质量25—30g，维持室温25℃，相对湿度65%—70%，日光/黑夜周期12h/12h(光照时间7∶00—19∶00)，分笼喂养，自由进食进水，饲养一周后进入实验。

1.1.2药物、试剂和仪器：米非司酮片(湖北葛店人福药业，批号H20033551)研磨后溶于丙二醇(国产分析纯，批号090115)，配置成浓度为0.08mg/0.1ml的米非司酮注射液。小鼠外周血单个核细胞分离液(批号LDS1090)购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；整合素β3抗体(批号bs-0342R)购自北京博奥森生物技术有限公司，VEGF抗体(批号BA0548)及免疫组化试剂盒(SABC法，批号SA1050)购自武汉博士德生物工程有限公司，TRIZOL试剂盒(批号15596-026)购自美国invitrogen公司，Real Time-PCR试剂盒(批号K1622)购自美国Fermentas公司。VEGF、整合素β3和β-actin引物均由上海基康公司设计并合成。BHS 型生物显微镜为日本奥林巴斯公司产品，ABI PRISM 7500型荧光定量PCR仪为美国BIO-Rad公司产品。

1.2方法

1.2.1PBMCs分离及其注射悬液制备：取1只雌性小鼠，眼球取血1ml于EDTA的抗凝管中，与PBS 1∶1混匀后，小心加入2ml外周血单个核细胞分离液液面，1 800 r/min离心20min后，吸收第二层环状乳白色的聚集物，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复洗涤3次即为所需PBMCs[4]。用PBS将上述PBMCs配制成1-2×107个细胞/ml应用溶液。

1.2.2动物分组及处理: 分批将雌、雄小鼠于晚上7∶00按2∶1比例合笼，次日早上7∶00发现阴栓者定为妊娠第1天(Pd1)。将发现阴栓的Pd1妊娠雌鼠84只随机分为对照组、着床障碍组及PBMCs处理组，每组各28只。对照组于Pd2上午9∶00经腹从两侧宫角向宫腔注射2.5μl PBS；着床障碍组于Pd2上午9∶00经腹从两侧宫角向宫腔注射2.5μlPBS，Pd4上午9∶00颈部皮下注射米非司酮注射液0.1ml复制着床障碍模型[5]；PBMCs处理组于Pd2上午9∶00经腹从两侧宫角向宫腔注射PBMCs应用液 2.5μl[4]，Pd4上午9∶00颈部皮下注射米非司酮注射液0.1ml。实验过程中小鼠饲养条件不变，分笼喂养，自由进食饮水。

1.2.3摘取子宫: 先从对照组和PBMC组随机抽取8只，从着床障碍组随机抽取10只雌鼠于Pd4晚22∶00用颈部脱臼法处死，剖腹取出子宫，切取1/2冻存于液氮中，另1/2浸泡于4%多聚甲醛中固定，分别进行子宫组织VEGF和整合素β3蛋白和mRNA检测。其余雌鼠，即对照组和PBMCs组各20只，着床障碍组18只于Pd8按上法处死和取出子宫，肉眼观察子宫内膜胚泡着床情况，着床率=每组着床小鼠只数/每组妊娠小鼠总只数。处死后小鼠统一交由同济医学院实验动物中心焚烧。抽血后小鼠和交配后雄性鼠继续喂养它用。

1.2.4免疫组化：将固定好的子宫组织按常规石蜡切片，经脱蜡、梯度酒精浸泡、3%H2O2灭活内源酶活性、热修复抗原。一抗兔抗VEGF或整合素β3多克隆抗体(1∶200)4℃孵育过夜，二抗抗兔IgG 37℃孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色(镜下控制反应时间)，显色后脱水，透明，封片。阴性对照用PBS代替一抗。显微镜下观察，棕黄色颗粒为VEGF或整合素β3阳性表达，根据着色由浅到深，将结果分为阴性(-)、弱阳性(±)、阳性(+)、强阳性(++)。采用美国Media Cybemetics图像技术公司Image-Pro Plus 6.0全自动图像分析仪分析每张切片各5个高倍视野(×400)棕黄色颗粒平均光密度值(Optical Density，OD)，OD值越高，VEGF或整合素β3表达量越高。

1.2.5Real Time-PCR：从液氮中取出小鼠子宫组织，冰上研磨收集细胞，提取总RNA，A260nm/A280nm吸光度均为1.8-2.0。用SYBR Green两步法逆转录成cDNA，以cDNA为模板扩增VEGF、整合素β3和β-actin，VEGF 上游引物为5’- ACA CAC CCA CCC ACA TAC AC -3’，下游引物为5’- ACA CAA GTC CAC AGC AGT CA -3’，扩增片段长度为157bp；整合素β3上游引物为5’- ACG TGC TGA CGC TAA CCG A-3’；下游引物为5’- ATA TGG GTC TTG GCA TCC G-3’，扩增片段长度为193bp；β-actin 上游引物为5’-CCG TGA AAA GAT GAC CCA G-3’，下游引物为5’- TAG CCA CGC TCG GTC AGG-3’ ，扩增片段长度为193bp。20μl反应体系中含2×SYBR Premix Ex TapTM 10μl，2.5μmol/L 引物 2μl(上下游各1μl)，50×ROX Reference DyeII 0.4μl，cDNA temples 1μl，dH2O 6.6μl。扩增反应条件95°C 30s预变性，95°C 5s，60°C 34s收集荧光信号，60°C 60s，共 40个循环，每个样本做3个平行管。采用7500荧光定量PCR仪分析各个标本的荧光强度，计算各自Ct值，用VEGF或整合素β3的Ct值减去β-actin的Ct值即为ΔCt,用2-ΔΔCt表示VEGF或整合素 β3的mRNA相对表达水平。

1.3统计学处理

2 结 果

2.1各组小鼠Pd8着床率比较

与对照组相比，着床障碍组的着床率显著降低(χ2=12.69，P<0.01)；PBMCs处理组较着床障碍组显著增加(χ2=10.56，P<0.01)，并接近对照组(χ2=0.143，P>0.05)。见表1。

表1 各组着床率比较

2.2各组小鼠Pd4子宫内膜VEGF和整合素β3蛋白表达水平比较

免疫组化染色结果显示，VEGF和整合素β3蛋白在各组子宫内膜组织均有表达(棕黄色颗粒)，主要定位在腔上皮和腺上皮，对照组为(++)，着床障碍组为(±)，PBMCs处理组为(+)，见图1。定量分析显示，与对照组相比，着床障碍组小鼠着床窗期VEGF和整合素β3蛋白OD值明显降低(t=-4.02、-3.34，均P<0.01)，PBMCs处理组小鼠着床窗期的VEGF和整合素β3蛋白OD值较着床障碍组显著增加(t=4.48、3.53，均P<0.01)，并接近对照组水平(t=0.72、0.52，均P>0.05)。见表2、图2。

注：A、B、C分别为对照组、着床障碍组、PBMCs处理组VEGF蛋白表达；D、E、F分别为对照组、着床障碍组、PBMCs处理组整合素β3蛋白表达

注：与对照组相同指标比较，*P<0.01；与着床障碍组相同指标比较，#P<0.01

表2 各组Pd4子宫内膜VEGF和整合素β3蛋白表达水平比较(OD值，

2.3各组小鼠Pd4子宫内膜VEGF和整合素β3mRNA水平比较

Real Time-PCR结果显示，与对照组相比，着床障碍组小鼠子宫内膜着床窗期VEGF和整合素β3mRNA表达显著降低(t=-3.28、-3.93，均P<0.01)，PBMCs处理组小鼠子宫内膜着床窗期的VEGF和整合素β3mRNA表达较着床障碍组显著增加(t=4.12、2.97，均P<0.01)，并接近对照组水平(t=0.64、0.44，均P>0.05)。见表3和图3。

表3 各组Pd4子宫内膜VEGF和整合素β3 mRNA水平比较(OD值，

注：与对照组比较，*P<0.01；与着床障碍组比较，#P<0.01

3 讨 论

PBMCs是外周血单个核细胞，主要由淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)、单核细胞和一小部分树突状细胞组成[6]。研究发现PBMCs能分泌各种细胞因子和炎性因子，直接作用于子宫内膜的免疫微环境，并能通过血液循环进入到卵巢中的黄体细胞周围，调节黄体功能，促进孕酮生成，刺激内膜分化，改善子宫内膜容受性，以更好地适应胚胎着床[7,8]。我们之前的体外研究显示PBMCs与滋养细胞共培养可促进滋养细胞分泌基质金属蛋白酶2(Matrix Metalloproteinase 2，MMP-2)和MMP-9，有利于滋养细胞侵袭和胚胎着床[9]，我们之前的临床研究观察到宫腔注射PBMCs可有效提高反复着床障碍患者的妊娠率[4]。为了探讨其机制，本次实验通过皮下注射米非司酮诱导小鼠着床障碍模型，并给予成模小鼠宫腔注射PBMCs，探讨PBMCs对着床率的改善作用以及子宫内膜VEGF和整合素β3的表达变化。结果表明宫腔注射PBMCs能明显提高米非司酮所致子宫内膜VEGF和整合素β3水平降低，进从而提升胚泡着床率。

胚泡着床是指发育至一定阶段的囊胚与具有容受性的子宫内膜相互接受的复杂动态过程，是临床妊娠成功的重要环节，其中的关键是子宫内膜容受性[2]。米非司酮作为孕激素受体拮抗剂，可干扰孕激素与其受体结合。已有报道小剂量米非司酮即能阻滞子宫内膜发育，使胚泡与子宫内膜发育不同步，从而影响卵泡着床，使妊娠率降低[10]。还有研究显示，VEGF也与子宫内膜容受关系密切，VEGF参与着床部位的血管新生和胎盘血管生成，并增加血管通透性，是子宫内膜容受的重要标志，但其表达不足会导致着床部位血管生成减少，早期绒毛形成不良，继而影响子宫内膜的容受性的建立[11]。我们通过宫腔注射PBMCs拮抗米非司酮对子宫内分泌功能的干扰及上调VEGF表达，有助于子宫内膜容受性的建立，有利于早期绒毛血管的形成，有利于胚泡成功着床、蜕膜化及胎盘形成。这一实验结果与Raine-Fenning[12]动物实验中分泌中期子宫内膜高表达VEGF，微血管密度达到高峰，有力促进了子宫内膜血管新生和胚胎着床作用等结果相一致。对于有学者提出子宫内膜血流的节律影响子宫内膜容受性以及VEGF表达水平可直接反映子宫血流量等有待进一步观察验证。

子宫内膜黏附分子表达的显著变化对子宫内膜容受性同样有着重要影响。整合素β3是一类存在于细胞表面的黏附分子，表达于黄体中期，尤其在种植窗期有特异性高表达，可介导胚泡和子宫内膜的交互对话，对胚泡的定位和黏附发挥着关键作用[13,14]。有研究[15]对体外受精胚胎移植患者的子宫内膜检测发现，妊娠组的子宫内膜整合素β3表达显著高于非妊娠组，阻断或封闭整合素的表达，胚泡着床被抑制，提示足量整合素β3表达对子宫内膜容受性的建立和妊娠的维持起着重要作用。本实验结果中，着床障碍组子宫内膜着床窗期的整合素β3蛋白及mRNA表达与对照组相比显著减少，而给予着床障碍模型小鼠宫腔注射PBMCs后，其表达显著增加，表明宫腔注射PBMCs能上调子宫内膜整合素β3的分泌，改善子宫内膜容受性，提高着床率。

综上，本研究结果显示宫腔注射PBMCs能通过提高着床窗期子宫内膜VEGF和整合素β3表达，有助于着床部位血管生成及胚泡的黏附，提高子宫内膜容受性，改善妊娠结局。但本研究也存在一些不足，如宫腔注射PBMCs对胚胎后续的影响不明确，其改善容受性的具体机制和对胚胎发育的影响有待进一步研究。◀