党参多糖联合沉默调节蛋白4对体外人脐静脉糖尿病血管内皮细胞凋亡的影响

苏洪义 贺娟娟 鲍 丽 李秀娟

糖尿病是一种慢性疾病，受到遗传、饮食等因素的影响，糖尿病心血管系统疾病是常见的糖尿病并发症，严重威胁着人们的生命健康[1]。糖尿病血管内皮损伤是糖尿病心血管系统疾病发生的重要原因，高糖条件下，血管内皮细胞凋亡水平升高，导致血管内皮完整的组织结构受到破坏，进而影响血管内皮正常功能[2]。党参多糖(Radix Codonopsis Polysaccharides)是提取自党参中的有效活性成分，具有提高机体免疫力、抗衰老、抗氧化的功效，党参多糖对于脑缺血再灌注损伤等具有改善作用[3]。有报道[4]，党参多糖可以明显改善糖尿病胰岛素抵抗。党参多糖处理能够减轻活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)诱导的血管内皮细胞氧化损伤[5]。沉默调节蛋白4(Sirtuin4,SIRT4)是SIRT家族成员，为一种ADP-核糖基转移酶，在人体组织中广泛表达。SIRT4与肿瘤、糖尿病发生有关[6]。有研究[7-8]表明，糖尿病患者体内SIRT4低表达，敲除SIRT4可诱发胰岛素抵抗。SIRT4具有抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡[9]。现阶段对于党参多糖和SIRT4在糖尿病血管内皮细胞损伤中的作用还不明确。本实验以30mmol/L的葡萄糖[2]处理血管内皮细胞体外模拟糖尿病血管内皮细胞损伤模型，探讨党参多糖联合SIRT4对糖尿病血管内皮细胞凋亡的影响及可能机制，以期为糖尿病心血管系统疾病的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

人脐静脉血管内皮细胞(YS908C)购自上海雅吉生物科技有限公司；细胞色素C(Cytochrome C，Cyt-C)抗体(11940)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase 3，C-Caspase-3)抗体(9661)购自美国Cell Signaling Technology；Lipofectamine 2000(11668027)购自美国Invitrogen；党参多糖(SR8560，纯度≥90%，100mg)购自北京索莱宝科技有限公司；PCR引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；SIRT4抗体(sc-135797)购自美国Santa Cruz Biotechnology；丙二醛(Malonaldehyde，MDA)测定试剂盒(BC0025)购自北京索莱宝科技有限公司；线粒体蛋白提取试剂盒(E1WP1031)购自南京恩晶生物科技有限公司； ROS测定试剂盒(E004-1-1)和超氧化物歧化酶 (Superoxide Orgotein Dismutase,SOD)测定试剂盒(A001-3-2)购自南京建成生物工程研究所；pcDNA-SIRT4、pcDNA均由和元生物技术(上海)股份有限公司构建；过氧化氢酶(Catalase, CAT)测定试剂盒( LM-A052)购自上海联迈生物工程有限公司；胞浆蛋白提取试剂盒(KTP3001)购自武汉艾美捷科技有限公司；流式细胞仪(CytoFLEX)购自美国贝克曼库尔特；荧光定量PCR仪(Qubit4.0)购自美国ABI；酶标仪(Varioskan LUX)购自美国Thermo Fisher；荧光显微镜(Leica DMi8)购自德国徕卡。

1.2细胞复苏、培养和传代

细胞复苏：将含有细胞的冻存管放入37℃的水浴箱中快速溶解，加入5ml含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液，1 000g离心5min，将上清溶液弃掉，加入5ml细胞培养液，将细胞接种到6cm的培养皿内培养，第二天观察细胞生长状态和密度。

细胞培养：细胞于37℃，5% CO2培养箱内培养，用含有10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液培养。

细胞传代：在倒置显微镜下观察细胞密度为80%以上时，将细胞培养液弃掉，然后加入0.25%胰蛋白酶消化液，放在37℃孵育1min，转移细胞溶液至离心管内，1 000g离心10min，弃掉上清，添加10ml的细胞培养液将细胞悬浮，根据后续实验要求将细胞按照不同的比例接种到新的培养板内。

1.3细胞转染和分组

细胞转染步骤如下：(1)将对数生成期细胞，接种到6孔板内于常规条件下培养，细胞密度为3×105个/孔，待细胞密度为60%时准备转染。(2)取灭菌以后的EP管，加入3μl的质粒(30pmol)和100μl的Opti-MEM溶液，混合均匀以后，放在冰上孵育结合5min。(3)另取灭菌后的EP管，加入3μl的Lipofectamine 2000和100μl的Opti-MEM溶液，混合后放在冰上孵育结合5min。(4)把(2)和(3)中的两种稀释液混合均匀后于室温下孵育20min，再将混合液添加到(1)中6孔细胞培养板中，继续于37℃、5% CO2培养。(5)培养6h以后，将培养板取出，弃上清，添加新鲜的含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液，继续培养24h后按照表1中处理方法分成6组，培养48h以后用于1.4中检测。

表1 细胞分组和处理方法

1.4检测指标和方法

1.4.1qRT-PCR检测SIRT4 mRNA表达: 应用Trizol试剂分别提取空白对照组、高糖模型组、转染阴性对照组和转染SIRT4组细胞中的总RNA，逆转录体系，0.5μl的Prime Script RT Enzyme Mix 、2μl的5×Prime Script Buffer、0.5μl的Oligo dT Primer、2μl的总RNA，补充RNase Free H2O至总体积为10μl。逆转录反应的条件为：37℃孵育15min；85℃孵育5s；放在-20℃保存。PCR反应体系为：1μl的Forward Primer、1μl的Reverse Primer、2μl的cDNA，添加ddH2O至25μl。PCR程序为：95℃ 10s；60℃ 30s；72℃ 30s，一共40个循环。以2-△△Ct法计算SIRT4 mRNA的相对表达量,β-actin为内参。扩增引物序列， SIRT4 Forward Primer：5’-TTG TGG GCT GGC CTC AAT TC-3’，Reverse Primer 5’-AGT GCA AAG CGT CCA CGT TC-3’。β-actin Forward Primer：5’-CGC TCT CTG CTC CTG TTC-3’，Reverse Primer 5’-ATC CGT TGA CTC CGA CCT TCA C-3’。

1.4.2Western blot检测SIRT4蛋白表达： 于空白对照组、高糖模型组、转染阴性对照组和转染SIRT4组细胞中添加冰预冷以后的PBS溶液，轻轻晃动细胞培养瓶，将细胞洗涤3次。在细胞中添加含有苯甲基磺酞氟(Phenyl Methyl Sulfony Fluoride, PMSF)采用放射免疫沉淀法(Radio-Immunoprecipitation Assay ,RIPA)裂解溶液，摇匀后置于冰上充分裂解。将裂解溶液吸取并转移到离心管内，4℃，12 000g离心10min，将上清溶液与等体积的上样缓冲液混合均匀，100℃煮沸5min。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，然后在上样孔中添加30μg的蛋白样品，在浓缩胶中使用80V的电压电泳，在分离胶中使用120V的电压电泳。当染料进入到分离胶的底部后，开始转膜。转膜在冰上进行，转膜电压为100V，时间为1h。转膜结束以后，将硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Filter Membrane，NC膜)放在5%脱脂奶粉封闭液中，室温孵育2h；然后把NC膜放在一抗稀释液中(一抗以1∶1 000稀释)，在4℃过夜反应；最后把NC膜置于二抗稀释液中(以1∶2 000稀释)，室温孵育2h。用电化学发光(Electro-Chemi-Luminescence ，ECL)法显影，扫描条带的灰度值，以 β-actin作为内参，SIRT4与β-actin蛋白条带灰度值的比值表示SIRT4蛋白的相对表达水平。

1.4.3噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium Bromide，MTT)测定细胞增殖： 空白对照组、高糖模型组、转染阴性对照组、转染SIRT4组、转染阴性+党参多糖组、转染SIRT4+党参多糖组，以104个/孔细胞于96孔板中培养48h后，在每个孔内加入20μl的MTT工作液，37℃孵育2h，弃上清，加入二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide,DMSO)溶液100μl，490nm波长处测定每个孔的光密度值(Optical Density ,OD值)，用OD值表示各组细胞相对增殖能力，OD值越大，细胞增殖能力越强。

1.4.4流式细胞术检测细胞凋亡：各组细胞经胰蛋白酶消化离心后，用PBS洗涤2次。随后添加400μl结合缓冲液混合后，再加入膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色溶液各5μl，于室温、避光条件下作用15min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4.5ELISA检测ROS、MDA、SOD、CAT水平检测： 收集细胞，分别用MDA检测试剂盒、SOD检测试剂盒、CAT检测试剂盒以及ROS检测试剂盒，ELISA检测细胞中MDA、SOD、CAT和ROS水平，步骤完全同试剂盒说明。ROS检测结果用荧光强度表示。

1.4.6线粒体膜电位检测： 各组细胞经胰蛋白酶消化后在细胞培养液中添加JC-1染色液，37℃作用20min后，1 500g离心10min，再加入JC-1染色缓冲液混合均匀，于4℃，1 200g离心10mi后，弃上清，添加1ml的JC-1染色缓冲液，于荧光显微镜下检测荧光强度。以空白对照组作为参照，分析其余各组细胞线粒体膜电位变化。

1.4.7Western blot检测C-Caspase-3、cyt-c蛋白表达： 提取细胞中的总蛋白，用胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞浆蛋白，用线粒体蛋白提取试剂盒提取线粒体蛋白，Western blot检测胞浆和线粒体中cyt-c蛋白以及总蛋白中C-Caspase-3蛋白表达水平，Western blot步骤同1.4.2，cyt-c抗体工作浓度为1∶800，C-Caspase-3抗体工作浓度为1∶600。

1.5统计学处理

2 结 果

2.1SIRT4过表达载体对体外糖尿病血管内皮细胞中SIRT4 mRNA和蛋白表达的影响

各组 SIRT4 mRNA和蛋白水平差异均有统计学意义(P<0.01)。高糖模型组血管内皮细胞中SIRT4 mRNA和蛋白水平均明显低于空白对照组(t=12.30、12.91，P<0.01)；转染SIRT4组血管内皮细胞中SIRT4 mRNA和蛋白水平均明显高于转染阴性对照组(t=18.03、14.15，P<0.01)。见图1和表2。

图1 各组血管内皮细胞SIRT4蛋白(Western blot)

表2 各组血管内皮细胞SIRT4 mRNA和蛋白水平比较均=9)

2.2党参多糖联合SIRT4对体外糖尿病血管内皮细胞增殖影响

各组细胞增殖能力差异均有统计学意义(P<0.01)。高糖模型组血管内皮细胞增殖能力明显低于空白对照组(t=12.52,P<0.01)；转染SIRT4组、转染阴性+党参多糖组、转染SIRT4+党参多糖组血管内皮细胞增殖能力明显高于转染阴性对照组(t=8.06、7.80、17.44，P<0.01)；转染SIRT4+党参多糖组血管内皮细胞增殖能力明显高于转染SIRT4组和转染阴性+党参多糖组(t=7.43、5.62,P<0.01)。见表3。

表3 党参多糖联合SIRT4处理后糖尿病血管内皮细胞OD值均=9)

2.3党参多糖联合SIRT4对体外糖尿病血管内皮细胞凋亡的影响

各组细胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平差异均有统计学意义(P<0.01)。高糖模型组血管内皮细胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平明显高于空白对照组(t=26.21、29.52 ,P<0.01)；转染SIRT4组、转染阴性+党参多糖组、转染SIRT4+党参多糖组血管内皮细胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平明显低于转染阴性对照组(t=6.27、7.94、15.13、13.04、14.76、20.74，P<0.01)；转染SIRT4+党参多糖组血管内皮细胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平明显低于转染SIRT4组和转染阴性+党参多糖组(t=37.71、11.16、8.91、8.72，P<0.01)。见图2、图3和表4。

图2 各组血管内皮细胞凋亡(流式细胞术)

图3 各组血管内皮细胞C-Caspase-3蛋白表达影响(Western blot)

表4 党参多糖联合SIRT4处理后糖尿病血管内皮细胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平均=9)

2.4党参多糖联合SIRT4对体外糖尿病血管内皮细胞氧化损伤影响

各组细胞ROS、SOD、MDA、CAT水平差异均有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较，高糖模型组血管内皮细胞ROS、MDA水平升高，SOD和CAT活性下降(t=11.31、16.99、24.21、26.02，P<0.01)；与转染阴性对照组比较，转染SIRT4组、转染阴性+党参多糖组、转染SIRT4+党参多糖组血管内皮细胞ROS、MDA水平下降，SOD和CAT活性升高(t=6.51、7.33、14.65、10.12、10.59、17.13、25.58、26.52、49.20、8.67、9.95、13.89，P<0.01)；与转染SIRT4组和转染阴性+党参多糖组比较，转染SIRT4+党参多糖组血管内皮细胞ROS、MDA水平降低，SOD和CAT活性升高(t=7.42、4.93、8.72、6.68、7.73、8.62、12.00、15.59，P<0.01)。见表5。

表5 各组血管内皮细胞中ROS、SOD、MDA、CAT水平比较均=9)

2.5党参多糖联合SIRT4对体外糖尿病血管内皮细胞线粒体膜电位和cyt-c蛋白表达影响

各组细胞胞浆、线粒体中cyt-c蛋白表达水平和细胞线粒体膜电位差异均有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较，高糖模型组血管内皮细胞胞浆中cyt-c蛋白水平升高，线粒体中cyt-c蛋白水平和线粒体膜电位下降(t=26.56、20.46、14.40，P<0.01)；与转染阴性对照组比较，转染SIRT4组、转染阴性+党参多糖组、转染SIRT4+党参多糖组血管内皮细胞胞浆中cyt-c蛋白水平降低，线粒体中cyt-c蛋白水平和线粒体膜电位升高(t=9.73、8.40、20.07、5.62、7.21、12.29、5.41、7.03、13.40，P<0.01)；与转染SIRT4组和转染阴性+党参多糖组比较，转染SIRT4+党参多糖组血管内皮细胞胞浆中cyt-c蛋白水平降低，线粒体中cyt-c蛋白水平和线粒体膜电位升高(t=19.60、14.31、5.76、5.62、7.48、7.32，P<0.01)。见图4、图5和表6。

表6 各组血管内皮细胞胞浆、线粒体cyt-c蛋白表达及细胞线粒体膜电位水平比较均=9)

图4 各组血管内皮细胞胞浆cyt-c蛋白水平(Western blot)

图5 各组血管内皮细胞线粒体cyt-c蛋白水平(Western blot)

3 讨 论

糖尿病是世界范围内常见的慢性疾病，其并发症是影响人类生命健康的重要原因，糖尿病心血管系统疾病是最为常见的糖尿病并发症之一[10]。糖尿病患者体内的高血糖可以刺激血管内皮细胞损伤，诱导细胞凋亡，进而造成血管内皮功能紊乱，诱导疾病的发生[11]。党参多糖是党参的活性成分，具有多种药理学作用，可以提高机体免疫力、改善氧化损伤[12]。近些年来研究报道显示，党参多糖可以有效改善糖尿病相关并发症[4]。党参多糖还可以降低ROS诱导的血管内皮细胞损伤[5]。本实验结果表明，高糖条件下血管内皮细胞增殖能力下降，凋亡增加，党参多糖干预后糖尿病血管内皮细胞损伤模型细胞增殖能力升高，凋亡减少，提示党参多糖具有抑制糖尿病血管内皮细胞损伤的作用。

SIRT4是线粒体内的NAD+依赖的ADP-核糖转移酶，其可以催化ADP-核糖转移酶与特定的靶蛋白结合，还能调控脂肪酸代谢和分泌胰岛素[13]。SIRT4参与肿瘤、中枢神经系统发育等过程[14]。近些年来发现，糖尿病患者SIRT4低表达，且敲除SIRT4后可促进胰岛素抵抗发生[7，8]。SIRT4在血管内皮细胞损伤中发挥保护作用，可以抑制氧化性底密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡[9]。本实验结果表明，糖尿病血管内皮细胞损伤模型中SIRT4 mRNA和蛋白表达均下降，上调SIRT4后可以减少糖尿病血管内皮细胞凋亡，表明SIRT4在糖尿病血管内皮细胞模型中发挥保护作用。

研究显示，高糖诱导血管内皮细胞氧化损伤是糖尿病血管内皮细胞凋亡的重要原因[15]。细胞内抗氧化酶如CAT、SOD活性下降后可诱导细胞内ROS水平聚集，而过量的ROS可将细胞中的脂质过氧化，造成氧化损伤，还可以刺激线粒体诱导线粒体膜电位发生变化[16，17]。MDA是脂质过氧化的产物。正常情况下，cyt-c多存在于线粒体内，当线粒体膜电位发生改变时，线粒体中的cyt-c才能够进入细胞浆，激活细胞Caspase凋亡级联反应[18]。Caspase是一类与细胞凋亡有关的凋亡蛋白家族成员，正常情况下，该家族成员多以无活性的酶原形式存在，只有被活化后才可以诱导细胞凋亡发生[19]。Caspase-3是Caspase凋亡级联反应下游的凋亡执行因子，其活化后形成C-Caspase-3不可逆诱导细胞凋亡发生[20,21]。本文结果显示，党参多糖和SIRT4以及二者联合都可以降低糖尿病血管内皮细胞中C-Caspase-3表达水平，降低细胞中ROS和MDA水平，提高SOD和CAT活性，提高线粒体膜电位，减少胞浆Cyt-C蛋白，说明党参多糖联合SIRT4可能通过抑制氧化应激和线粒体凋亡途径减少细胞凋亡。

综上所述，党参多糖联合SIRT4抑制体外糖尿病血管内皮细胞凋亡，其作用机制可能与二者均可抑制氧化应激诱导的线粒体凋亡途径有关，这为研究糖尿病血管内皮损伤机制提供了参考，为临床上治疗糖尿病心血管系统疾病提供了可能思路。◀