血清外泌体来源的microRNA-221-3p在肝细胞癌中的表达及意义

吴俊艺， 赖智德， 田毅峰， 王耀东

1 福建省立医院 肝胆胰外科， 福州 350001; 2 南京大学医学院附属南京鼓楼医院 肝胆胰外科， 南京 210008

肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，HCC的发展具有多种癌症特征，如持续性细胞增殖、逃避凋亡、诱导血管生成和侵袭转移等[1]。目前较为公认的有效HCC治疗方式主要是手术切除及肝移植，但是HCC发病隐匿，进展迅速，绝大多数肿瘤一经发现即是晚期，从而失去手术时机[2]。因此，深入研究HCC的发病机制、寻找新的HCC早期诊断标志物具有重要意义。目前临床上AFP的检测是HCC筛查的主要手段，但是其对HCC的敏感性较低，所以寻找其他对HCC具有特异性的肿瘤标志物尤为重要[3]。最近，多项研究[4-5]结果表明，血清外泌体中异常表达的microRNA(miRNA)与多种肿瘤发生、发展及预后紧密相关，可能成为一种新型的肿瘤诊断分子标志物。然而，关于血清外泌体来源的miRNAs在HCC诊断及预后中的研究相对较少。本研究分析血清外泌体来源miRNA-221-3p的表达水平与HCC患者的临床特征及预后的相关性，旨在探讨血清外泌体来源miRNA-221-3p作为新型分子标志物在HCC早期诊断及预后判断中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2010年2月-2014年12月南京大学医学院附属南京鼓楼医院经手术治疗后组织病理诊断为HCC的66例患者进行回顾性研究，选取25例同期在本院接受健康检查的体检者作为对照组。随访截止时间 2019年2月，HCC患者的生存时间为从手术开始到因任何原因死亡或最后1次随访的时间。诊断及临床分期参照《原发性肝癌诊疗规范( 2017年版)》[6]。入选标准：(1)首次手术切除患者，术后病理诊断为HCC; (2) 无其他心肺肾等严重基础疾病。排除标准: (1)临床资料不完整及失访者; (2) 合并心、肺、肾等严重基础疾病者; (3) 非原发病灶者; (4) 妊娠期及哺乳期妇女。

1.2 主要试剂 外泌体提取试剂盒ExoQuickTM Kit购买自美国System Biosciences公司，CD63抗体、Alix抗体和HSP70抗体购买自美国Abcam公司，Trizol RNA 提取试剂购买自美国 Life Technologies 公司，RNA 反转录试剂盒及SYBR Green Real-time PCR 试剂盒购买自日本Takara公司。

1.3 方法

1.3.1 外泌体的提取 分别取HCC组及对照组血清，根据ExoQuickTM Kit说明书提取血清外泌体，根据后续实验需要用PBS缓冲液、蛋白质裂解液及RNA裂解液重悬沉淀。

1.3.2 透射电子显微镜检测血清外泌体 血清外泌体(10 μg)滴于专用铜网上(购自北京中兴科依科技有限公司)，1%戊二醛固定液固定10 min，PBS缓冲液漂洗，室温静置待挥干，2%磷钨酸负染后采用透射电子显微镜(JEM-2100)在100 kV电压下进行观察并拍照。

1.3.3 蛋白免疫印迹 通过含有蛋白酶抑制剂的裂解液重悬血清外泌体后提取总蛋白进行分析。将提取后的蛋白加入聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离后，将其转移到PVDF膜上后，以5%脱脂牛奶封闭1 h后，anti-HSP70及anti-CD63一抗在4 ℃冰箱中孵育过夜，PBS缓冲液冲洗后二抗孵育1 h，采用化学发光法显色并拍照(Tanon 5200成像系统)。

1.3.4 实时荧光定量PCR miRNA-221-3p引物，上游：5′-AGACCTGATACTGAGTGAAG-3′，下游：5′-GACGTCGAGATCGCATAG-3′；U6 引物，上游：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′，下游：3′-CAGCATAGGTCACGTCCCAGGCTCCATAAGCGTGACCTATGCTCTTTTAT-5′，由广州锐博公司设计与合成。用RNA提取试剂(Trizol)重悬血清外泌体后，按照常规Trizol法提取血清外泌体的总RNA，测定提取总RNA浓度，按照RNA反转录试剂盒说明书进行反转录，条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保持。逆转录后按照SYBR Green Real-time PCR试剂盒说明书操作，条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃复性34 s，重复2、3步骤40个循环，血清外泌体来源的miRNA-221-3p表达水平采用2-ΔΔCt计算。

1.4 伦理学审查 本研究通过南京大学医学院附属南京鼓楼医院伦理委员会批准(批号：20180120)。

1.5 统计学方法 采用 SPSS18.0统计软件进行数据分析。非正态分布的计量资料两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，计数资料两组间比较采用χ2检验。采用 Kaplan-Meier方法及 log-rank 检验分析HCC患者的预后，采用 Cox 比例风险回归模型分析预后的影响因素。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清外泌体的形态特征 血清外泌体可表达HSP70、CD63和Alix(图1a)，外泌体外观为圆形或椭圆形囊泡状结构，直径为40～100 nm(图1b)。

2.2 HCC患者血清外泌体中miRNA-221-3p的表达水平HCC组血清外泌体来源的miRNA-221-3p表达水平高于对照组，差异具有统计学意义(U=354.00，P<0.001)(图2)。

2.3 HCC患者血清外泌体中miRNA-221-3p的表达水平与临床病理特征及预后的关系 根据HCC患者血清外泌体中miRNA-221-3p的表达水平升高3倍设定为cut-off值，将其分为高表达组(n=40)和低表达组(n=26)。HCC患者血清外泌体中miR-221-3p高表达组与低表达组的肿瘤大小(χ2=6.016，P=0.014)、包膜侵犯(χ2=7.580，P=0.006)和TNM分期(χ2=6.340，P=0.012)比较差异均有统计学意义，而在性别、年龄、乙型肝炎、分化程度、AFP以及肝硬化等方面差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表1)。Kaplan-Meier生存曲线的结果显示，高表达组的总生存期明显短于低表达组(χ2=17.105，P<0.001)(图3)。

表1 HCC患者血清外泌体miRNA-221-3p的表达水平与临床病理特征的关系[例(%)]

2.4 HCC患者的预后危险因素分析 采用 Cox 比例风险回归模型分析HCC患者的预后危险因素，单因素分析结果显示:肿瘤大小、包膜侵犯、TNM分期及血清外泌体中miRNA-221-3p的表达水平是HCC患者预后的危险因素(P值均<0.05)。多因素Cox分析结果显示：血清外泌体来源的miRNA-221-3p表达水平[风险比(HR)=2.434，95%可信区间(95%CI): 1.178～5.027，P=0.016]及TNM分期(HR=2.653，95%CI: 1.222～5.760，P=0.014)是影响HCC患者预后的独立危险因素(表2)。

表2 影响HCC患者预后的危险因素分析

3 讨论

外泌体是一种直径40～100 nm的膜性囊泡，广泛分布在人体体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等[7]。外泌体含有多种生物活性的成分，例如蛋白质、脂质、mRNA和miRNA等，参与细胞间通讯、免疫应答、蛋白及核酸运输等生理过程[7]。越来越多的研究[8-9]表明，内含于外泌体中的多种miRNAs在恶性肿瘤的发病及进展中具有重要作用，可以作为肿瘤早期诊断及预后判断的新型分子标志物。外泌体中miRNA可简便地从血清中收集，并且其分析相对简单。检测外泌体中miRNA的表达水平是无创性的，因此外泌体中miRNA具有成为早期癌症筛查生物标志物的潜力。

以往研究[10-11]发现HCC患者血清外泌体中miRNA-21的表达水平升高且与预后相关，而血清中miRNA-21表达水平相对较低，说明血清外泌体中miRNA异常表达对HCC的早期诊断及预后判断更具潜在价值。另一种血清外泌体来源的miRNA-125b可以作为预测HCC预后的指标[12]。另有Qu等[13]研究发现外泌体来源的miRNA-665与HCC患者包膜浸润、肿瘤大小、临床分期及总生存期等密切相关。张云等[14]研究发现血清外泌体来源的miRNA-122对HCC的诊断效能明显高于AFP，可作为一种新型的用于HCC早期临床诊断的分子标志物。也有研究[15]发现外泌体中miRNA-718与肝移植术后HCC患者的预后相关，并且最近研究[16-17]发现血清外泌体中miRNA-224和miRNA-638可以促进HCC的进展，与HCC的复发、转移及预后相关。但是目前血清外泌体中miRNA在HCC的早期临床诊断及其发生发展中的作用和具体分子机制仍需要进一步研究。

本课题组通过Western Blot检测发现，血清外泌体含有HSP70、Alix及CD63标志性蛋白，通过透射电镜发现血清外泌体外观为圆形或椭圆形囊泡状结构，直径为40～100 nm，符合外泌体形态。通过实时荧光定量PCR检测HCC组及对照组中血清外泌体来源的miRNA-221-3p的表达水平，发现在HCC患者中，血清外泌体来源的miRNA-221-3p表达水平高于对照组，并且miRNA-221-3p高表达与HCC患者肿瘤大小、包膜侵犯及临床分期等密切相关，提示其表达水平与HCC患者较差的临床病理特征有关。在此研究基础上，采用Kaplan-Meier生存曲线分析血清外泌体来源miRNA-221-3p的表达水平与总生存期的关系，结果显示，miRNA-221-3p高表达组的总生存期明显短于低表达组，预后不佳。进一步研究还发现，血清外泌体中miRNA-221-3p的表达水平及肿瘤分期是HCC患者预后的独立危险因素，说明血清外泌体miRNA-221-3p的表达水平具有判断HCC预后的潜在价值。综上所述，HCC患者血清外泌体中miRNA-221-3p 表达水平明显上调，且与临床病理特征及预后有关，可能作为HCC患者新型临床预后的判断指标。但血清外泌体中miRNA-221-3p在HCC发生发展的具体分子机制仍需要进一步探索。随着外泌体提取技术的发展及其在分子机制的深入研究，相信外泌体来源miRNA作为恶性肿瘤早期诊断及预后判断的参考指标具有广阔的前景。