急性肝衰竭犬模型肝细胞膜表面OATP1及MRP2蛋白表达与钆塞酸二钠增强MRI信号强度的相关性分析

王 昊， 陈 好， 欧阳中敏， 刘志强

广州医科大学附属第五医院 a.消化内科； b. 影像科， 广州 510700

急性肝衰竭(ALF) 是由多种因素所致肝脏的合成、解毒、排泄以及生物转化等功能发生失代偿或引发严重的器官功能衰竭的临床症候群，病死率高达70%～80%[1]。新型造影剂钆塞酸二钠(Gd-EOB-DTPA)行MRI增强扫描作为节段性评估肝功能的方法是近年来的研究热点[2-3]。笔者前期通过对CCl4诱导建立的犬类ALF模型行Gd-EOB-DTPA增强MRI扫描，探索不同时期感兴趣区域的信号强度与肝细胞病理及细胞结构变化的关系，发现20 min为肝细胞最佳成像时间，且增强扫描后信号强度越低，肝细胞结构破坏越严重[4]。由此推测Gd-EOB-DTPA行MRI增强扫描也可以节段性评估ALF患者的肝功能。已知有机阴离子转运肽1(organic anion transporting polypep tide 1，OATP1)能够介导肝细胞对Gd-EOB-DTPA的摄取，而多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)则介导Gd-EOB-DTPA经胆汁排泄[5]。因此，本研究进一步探讨ALF Beagle犬在Gd-EOB-DTPA增强MRI注射造影剂20 min时不同信号区的肝脏信号强度与跨膜蛋白OATP1及MRP2表达变化的相关性，以期得出一个能从节段性水平快速评估ALF时肝功能的方法，目的是建立一个具有分子生物学层面评估肝细胞功能的ALF犬模型，为优化治疗方案提出依据。

1 材料与方法

1.1 药物诱导ALF犬模型建立 选取10～12月龄健康成年雄性Beagle犬16只[购自福州振和实验动物技术开发有限公司，合格证号：SCXK(闽2012-0002)，生产许可证编号：SCXK(闽2018-0001)，实验动物使用许可证编号：SYXK(粤2012-0117)]。体质量约(13.0±3.0)kg，随机分为空白对照组(A组，n=8)和ALF组(B组，n=8)。采用乙酰氨基酚联合CCl4诱导ALF的方法进行造模，具体方法参照前期研究方案[6]。

1.2 Beagle犬采用Gd-EOB-DTPA进行MRI增强平扫 造模24 h，采用犬眠宝0.06 ml/kg肌肉注射对Beagle犬进行全身麻醉，麻醉前15 min皮下注射硫酸阿托品(浙江浙北药业有限公司)1 ml预防误吸。将麻醉后的Beagle犬固定在磁共振检查床上，每条Beagle犬采用1.5T核磁共振成像仪进行MRI平扫，扫描前禁食禁水6～8 h;扫描序列包括T1WI同反相位(矩阵208×256，重复时间110.0 ms，回波时间2.38 ms、4.76ms)、T1WI(矩阵188×256，重复时间169.0 ms，回波时间4.76 ms)、T2WI(矩阵320×320，重复时间2200.0 ms，回波时间90.0 ms)。扫描范围为横隔顶至肝脏下缘;扫描体位为俯卧位。采用8通道相控阵体部线圈。扫描视野为130×320 mm，反转角度10°，获得时间16 s。

平扫结束后注射对比剂Gd-EOB-DTPA(商品名“普美显”Primovist，拜耳先灵医药，德国)，注射剂量为0.1 ml/kg，人工静脉推注，流率为2 ml/s。注射对比剂后用10 ml生理盐水进行冲洗，冲洗流率为2 ml/s。

Gd-EOB-DTPA增强MRI扫描：动态增强扫描序列使用3D扰相容积序列的脂肪抑制T1加权梯度回波影像，延迟20 min扫描为肝细胞期，扫描序列为FS 3D(矩阵130×320，重复时4.08 ms，回波时间1.65 ms，层厚3 mm，层间距0)。肝脏MRI检查结束后，将数据传输到工作站。

1.3 MRI增强扫描前后数据测定 选择1名具有10年工作经验且经伦理委员会认证的腹部放射科医师，根据B组在注射Gd-EOB-DTPA 20 min后所获得的图像判断是否存在不同增强程度的区域，以正常A组肝脏T1W1信号强度作为参照，B组分别于MRI增强扫描前及20 min后于肝脏同一轴向层面呈现高、中、低不同信号区域。避开肉眼可见的胆管及血管，分别选择两组在MRI增强扫描前、增强扫描20 min时肉眼所见的不同增强程度区域作为感兴趣区域(直径约3～6 mm)，测量该区域对应的信号强度(signal intensity，SI)，每个感兴趣区测量3次。首过快速上升期中的增强斜率百分比计算公式：(SImax-SIbase/ SIbase×△t)×100%。

SImax指时间-信号曲线首过灌注肝脏所达到的最大值，SIbase指造影剂增强扫描后进入动脉期前最先获得的两幅图像中所得的平均信号值。△t指从SIbase至SI1st的时间间隔[7]。该数据由后处理工作站上的特定软件(Mean Curve，Syngo MR D13，SiemensHealthcare)进行分析。通过软件计算得出两组不同信号值的时间-信号曲线。

1.4 MRI定位下穿刺 B组根据注射造影剂Gd-EOB-DTPA后20 min(肝细胞期)的MRI图像选择同一轴向层面的高、中、低不同信号区作为感兴趣区域进行肝穿刺。A组选择Gd-EOB-DTPA行MRI增强扫描后在相应区域进行肝穿刺。使用一次性活检针(巴德医疗科技上海有限公司代理)进行肝穿刺活检，穿刺时注意避开肉眼所见血管、胆管、病灶。每个感兴趣区均取1份约0.1 g的肝组织，用于Western Blot法检测跨膜蛋白OATP1及MPR2的表达情况。

1.5 Western Blot检测OATP、MRP2蛋白的表达

1.5.1 蛋白的提取及测定 将肝组织块研磨捣碎后加入200 μl的RIPA裂解液(Solarbio，中国)，在冰上吹打混匀，4 ℃放置10 min，4 ℃ 12 000×g，离心5 min，收集上清。将提取到的蛋白根据BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher，美国)的使用说明进行蛋白浓度测定。分别取200 μl蛋白上清加200 μl纯水混匀，加入80 μl的5×loading buffer，混匀，沸水煮5 min变性，冷却至室温，-20 ℃保存。

1.5.2 Western Blot取30 μl蛋白样品进行上样，使用10%分离胶与5%浓缩胶配比的电泳胶于蛋白电泳仪(Bio-Rad，美国)上进行电泳分离。然后电转移至PVDF膜(Millipore，美国)，5%脱脂牛奶中摇床封闭1 h，TBST洗膜2次后加入相应一抗(OATP1、MRP2，Abcam，英国)并于4 ℃条件下孵育过夜。孵育结束后用TBST洗去一抗，然后加入相应二抗,室温摇床2 h。最后于凝胶成像系统上成像记录，然后用Image J图像分析软件测定各蛋白的灰度值，并将目的蛋白(OATP1、MRP2)灰度值与内参GAPDH(上海碧云天生物技术有限公司)灰度值的比值作为OATP1及MRP2的相对表达量。

1.6 伦理学审查 本研究方案经由暨南大学实验动物伦理委员会审批(批号：20150310002)，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 两组不同信号区域首过快速上升期中的信号值、增强斜率百分比 B组行Gd-EOB-DTPA增强MRI扫描前后高(H)、中(M)、低(L)信号区域测得SIbase值之间差异有统计学意义(P<0.001)，进一步两两比较差异均有统计学意义(tHM=6.88，PHM<0.001；tHL=11.84，PHL<0.001；tML=4.96，PML<0.001)； SIst值比较差异亦有统计学意义(P<0.001)，进一步两两比较差异亦均有统计学意义(tHM=5.46，PHM<0.001；tHL=10.49，PHL<0.001；tML=5.03，PML<0.001)；首过快速上升期中的增强斜率百分比比较差异有统计学意义(P<0.001)；增强斜率百分比之间两两比较差异亦均有统计学意义(tHM=3.7，PHM<0.001；tHL=6.3，PHL<0.001；tML=2.7，PML<0.001)；A组行Gd-EOB-DTPA增强MRI扫描前后H、M、L信号区域测得SIbase值、SIst值、△t、强斜率百分比，两组间比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)(图1，表1)。

表1 两组首过快速上升期中的增强斜率百分比

2.2 OATP1和MRP2的表达水平 B组不同MRI信号区域的肝组织中，造影剂摄取蛋白OATP1及造影剂排泄蛋白MRP2的表达存在差异(P值均<0.05)。A组不同信号区之间OATP1的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。B组H、M、L信号区之间OATP1的表达呈逐渐下降的趋势，M、L信号区OATP1的表达与A组相比差异均有统计学意义(t值分别为3.301、3.641，P值均<0.05)。B组L信号区OATP1的表达与H、M信号区比较均有显著下降，且差异具有统计学意义(tHL=3.436，PHL=0.002；tML=2.378,PML=0.024)。A组不同信号区之间MRP2的表达比较无统计学意义(P>0.05)。B组H、M、L信号区MRP2的表达呈逐渐升高的趋势，H、M、L不同信号区MRP2的表达分别与A组相比差异均有统计学意义(t值分别为-7.236、-8.130、-9.614，P值均<0.05)。在B组H信号区MRP2的表达比M、L信号区均低，且其差异有统计学意义(tHM=-2.666，PHM=0.013；tHL=-3.897，PHL=0.001)(图2，表2)。

表2 两组OATP1、MRP2蛋白相对表达情况

2.3 OATP1、MRP2蛋白表达水平与信号强度的相关性

B组H、M、L信号区OATP1蛋白表达水平与增强后MRI信号强度呈正相关(r=0.692，P<0.05)，B组H、M、L信号区MRP2蛋白表达水平与增强后MRI信号强度呈负相关(r=-0.514，P<0.05)(图3)。

3 讨论

ALF是由多种因素综合导致肝损伤继而引起肝性脑病、凝血障碍、黄疸、腹水等症状，使肝功能发生失代偿或引发严重的器官功能衰竭。目前临床上评估肝功能的方法如Child-Pugh分级、ICG血浆清除率及MELD评分系统等虽然能为肝病患者治疗方案的制订提供重要的参考价值[8]，但由于其相关评价指标在检测过程易受干扰，很难从客观上准确评价ALF时的肝功能及人工肝治疗前后的肝功能。ALF发病后，肝组织损伤存在区域差异，因此，观察治疗前后不同损害严重程度肝细胞功能恢复情况，是临床判断治疗效果的重要方法，随着MRI影像学检查的深入，新型造影剂如Gd-EOB-DTPA在肝脏疾病的应用受到越来越多学者的关注。

Gd-EOB-DTPA作为肝脏特异型造影剂在正常人体内静脉推注后分布在细胞外间隙，大约有50%由正常功能的肝细胞通过细胞膜上表达的跨膜蛋白及OATP1摄取，然后经由肝细胞毛细胆管细胞膜上的载体MRP2排泄入胆汁，剩余约50%通过肾脏途径清除。现有的研究[9]表明，在Gd-EOB-DTPA注射1.5 min后开始被肝细胞摄取，约20%的给药剂量在20 min时被转移到肝细胞中。笔者前期研究[4]通过对犬类ALF模型组和空白对照组均采用Gd-EOB-DTPA行MRI增强扫描，并测定平扫期、增强20 min不同时间感兴趣区域信号强度进行对比，发现ALF组Beagle犬增强20 min时MRI显示肝脏强化程度不一，呈高、中、低不均匀强化，以MRI增强20 min时信号值差异更明显。因此，可采用Gd-EOB-DTPA注射后20 min时获得的MRI图像作为“标准”来评估大多数的肝损伤和肝功能[10]。此次研究进一步测定时间-强度曲线的快速上升期，由此认为Gd-EOB-DTPA造影剂从动脉毛细血管进入肝脏细胞间隙过程中以20 min作为最佳上升期，增强斜率反映的是对比剂浓度上升的速率，可随着微循环血流量的增多，造影剂浓度上升的速率也会加快[10]。相反，若肝细胞功能受损，引起内皮细胞受损及肝脏微循环障碍，对应对比剂浓度上升速率减慢，因而肝衰竭组低信号区域首过灌注后信号强度达到一定峰值后未再继续升高。

肝细胞质膜上不同区域的膜蛋白可通过各自不同转运的机制到达细胞的特定部位，行使不同功能。OATP1是属于溶质载体超家族的一种跨膜蛋白，它能介导多种有机化合物如Gd-EOB-DTPA通过肝脏基底膜，使其能够快速被摄入肝细胞内。据报道[11]，OATP1的表达在肝炎、肝硬化中表达下调。Ding等[12]及Katsube等[13]研究证实，正常肝细胞数量的减少及OATP1功能的减退会导致肝细胞对Gd-EOB-DTPA摄取量减少，从而解释肝纤维化时T1弛豫时间减少，信号降低。由此可知，肝脏相关疾病通过MRI增强扫描信号的高低程度与OATP1的表达相关。本研究将MRI定位下穿刺取得的肝组织采用Western Blot法检测OATP1的表达情况，结果发现，ALF组H、M、L不同信号区OATP1的表达与对照组相比呈逐渐下降的趋势，并与肝细胞期信号减低的趋势相一致。结合既往研究[4]HE染色结果提示MRI信号强度的高、低与肝组织HE染色下显示的坏死程度呈负相关，即肝组织坏死越严重的区域MRI信号强度越低。由此可以说明，Beagle发生ALF时，肝脏信号强度上升不明显，OATP1的表达越低，对应区域的MRI信号增强越不明显，这与Ding等[12]及Katsube等[13]的研究结果相一致。

MRP2是属于ABC超家族的一类跨膜转运蛋白，主要分布于肝细胞毛细胆管膜上，能够促进两性阴离子化合物排泄进入胆汁[14]。Saito等[15]研究发现MRP2蛋白的下降可导致Gd-EOB-DTPA的蓄积，从而引起MRI早期信号强度的增强。由此可以推测，当MRP2表达升高时，肝细胞内Gd-EOB-DTPA经MRP2蛋白介导排泄入胆汁增加，Gd-EOB-DTPA增强MRI的信号可能减弱。本研究发现，ALF组MRP2的表达随着肝损伤程度的增大而升高，且均比对照组高。曾经有研究[16]报道，OATP在肝病中的表达是随着时间的推移而变化的，急性毒性处理(对乙酰氨基酚和CCl4)可以诱导MRP2的表达，而长期的CCl4诱导会降低MRP2的表达，这与本研究结果相一致。ALF组肝内H、M、L信号区MRP2的表达是逐渐升高的，而对应区域的MRI信号强度是逐渐下降，推测是由于MRP2对Gd-EOB-DTPA排泄增多所致。

本研究也存在一些局限性。本研究虽然证实了OATP1及MRP2在ALF Beagle犬肝内表达发生了改变，但并未深入研究引起这两种跨膜转运蛋白表达改变的具体机制，这是将来需要深入探讨的方向。

本研究结果表明，肝细胞期ALF Beagle犬增强MRI信号强度越低的区域，细胞膜表面OATP1的表达下降越明显，肝细胞受损严重区域细胞内无法摄取过多造影剂，信号强度上升的速率减慢。信号强度越低的地方MRP2的表达上升越明显，对造影剂的排泄越快。这就说明，急性肝细胞损伤时肝细胞期MRI信号的降低与OATP1及MRP2 的表达情况密切相关。笔者前期研究已经证明ALF Beagle犬肝内MRI信号的区域性差异与肝损伤程度相关。因此，认为肝细胞膜表面OATP1及MRP2 的表达水平与肝实质在Gd-EOB-DTPA增强肝细胞期的强化程度具有一定的关系，从而导致了肝内MRI增强信号的差异，这为节段性评估肝细胞功能提供一定依据。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：黄建伟负责课题设计及拟定写作思路；陈好负责论文撰写及数据收集、分析；王昊负责数据收集，分析及指导撰写文章；欧阳中敏、刘志强负责影像学数据收集及资料分析。