雷公藤多苷调控PI3K/AKT/mTOR通路对Graves病小鼠甲状腺功能和氧化应激状态的作用研究

张 洁，王思瑶，陆春晖，罗 荔

0 引言

Graves病又称为毒性弥漫性甲状腺肿(Toxic diffuse goiter)，是一种自身免疫性疾病，多数患者同时有高代谢症和甲状腺肿大，其发病机制目前尚不明确，可能与环境因素、精神因素、遗传因素、病毒及细菌感染等都有一定的关系[1-3]。目前，有研究表明，Graves病可能与甲状腺组织细胞PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活有关[2-5]。研究表明，雷公藤多苷具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤等作用，对痛风、类风湿性关节炎、糖尿病肾病等疾病均有疗效[6-8]，同时，能够调节PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达，发挥其抗肿瘤、卵泡修复等作用[9-11]。本文研究雷公藤多苷对Graves病小鼠甲状腺功能和氧化应激状态的作用及机制，为Graves病的临床治疗提供新的参考和依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 BALB/c雌性小鼠60只，SPF(Specific pathogen Free)级别，6周龄，体重18～20 g，购自新疆医科大学动物实验中心，购买后进行72 h适应性饲养，自由进食、饮水。雷公藤多苷购于浙江得恩德制药有限公司，PI3K、AKT、mTOR和GAPDH抗体均购自Proteintech公司，RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天公司，表达TSHR-A亚单位的重组腺病毒(Ad-TSHR289)购自北京诺赛基因组研究中心有限公司，ELISA检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，ECL显色液购自Thermo公司，全自动生化分析仪购自北京岛津公司，双垂直电泳仪、转印电泳仪、凝胶成像仪均购自伯乐生命医学产品有限公司。T3、T4、TRAb ELISA检测试剂盒均购自武汉菲恩生物科技有限公司。

1.2 Graves病小鼠模型的建立及给药 60只BALB/c小鼠12只作为对照组，其余采用Ad-TSHR 289免疫的方法建立Graves病小鼠模型[12-13]。取Ad-TSHR289 108 IU，用PBS稀释至50 μl后，胫前肌注，每隔3周1次，共3次，并于第3次免疫完成4周后，通过眼眶后静脉丛取血，以放射受体分析法测定小鼠血清TSH、TRAb，TRAb阳性同时伴T4升高、TSH水平降低者视为造模成功。将造模完成后的小鼠随机分为4组，每组12只，分别为模型组、雷公藤多苷低剂量组、雷公藤多苷中剂量组、雷公藤多苷高剂量组。雷公藤多苷低、中、高剂量组分别灌胃给予小鼠20、40、80 mg/kg雷公藤多苷[14-15]，对照组及模型组灌胃给予小鼠等量生理盐水，所有组别每天定时给药1次，连续给药21 d。最后一次给药结束24 h后，方可进行后续实验。

1.3 各组小鼠血清TRAb、T4、T3水平及肝功能指标的测定 小鼠通过眼眶静脉丛取血至干净离心管中，于4 ℃静置4 h，然后置于离心机中，4 ℃、3 500 r/min离心10 min。取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书检测小鼠血清TRAb、T4、T3水平，并利用全自动生化分析仪检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)水平。

1.4 小鼠SOD活性、GSH、MDA水平检测 小鼠处死后，迅速分离肝脏组织，按照SOD活性检测试剂盒说明书，检测各组小鼠肝脏SOD活性，参照GSH检测试剂盒说明书检测小鼠肝脏GSH水平，按照脂质氧化(MDA)检测试剂盒说明书检测小鼠肝脏MDA水平。

1.5 各组小鼠甲状腺组织样本的采集并计算甲状腺脏器指数 颈椎脱臼处死小鼠后迅速分离甲状腺组织，用4 ℃预冷的生理盐水清洗，除去血液，滤纸吸干表面水分后称重，计算脏器指数。然后将一部分甲状腺组织放入10%中性甲醛中固定，其余部分放入玻璃匀浆器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，置于4 ℃离心机，以12 000 r/min离心10 min，用移液枪将上清液移至另一干净离心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混匀后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃冰箱储存备用。脏器指数按照以下公式进行计算：脏器指数=甲状腺湿重(mg)/小鼠体重(g)×100%

1.6 组织病理学检查 将在10%中性甲醛中固定24 h后的小鼠甲状腺组织转移至75%的酒精中，经自动组织脱水机脱水、透明处理，在石蜡包埋机中浸蜡、包埋，进行5 μm切片，水浴展开，捞片，沥干，放恒温箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常规苏木精-伊红染色(E染色)，在显微镜下进行组织病理学观察。HE染色步骤：①脱蜡：将石蜡切片依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min；②复水：依次置于100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸馏水洗2 min，各2次，然后把水吸干；③苏木精染色：置于苏木精溶液中2 min，自来水流水冲洗2 min，把水吸干；④分化：1%盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，吸干水；⑤伊红染色：置于伊红溶液中2 min；⑥脱水：依次置于95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(Ⅰ)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min；⑦封片：置于通风橱，待乙醇彻底干后依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待载玻片上残留二甲苯挥干后用中性树胶封片。

1.7 Western blot实验 将冻存的小鼠甲状腺组织蛋白液于室温下融化后，采用BCA法测定蛋白浓度，处理好待测样品后，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转膜，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1 h，经PI3K、AKT、mTOR、GAPDH抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，PBST清洗后显色液显影，利用凝胶成像仪成像后，进行灰度值检测。

2 结果

2.1 雷公藤多苷对Graves病小鼠血清TRAb、T4、T3水平的影响 各组小鼠血清TRAb、T4、T3水平见表1。结果表明，与对照组相比，模型组Graves病小鼠血清TRAb、T4、T3水平均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，雷公藤多苷各剂量组小鼠血清TRAb、T4、T3水平均显著降低(P<0.05)，且表现出一定的剂量依赖性。

2.2 雷公藤多苷对Graves病小鼠肝功能的保护作用 各组小鼠血清ALT、AST、ALP水平见表2。结果表明，与对照组相比，模型组小鼠血清ALT、AST及ALP水平均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，雷公藤多苷各剂量组小鼠血清ALT、AST及ALP水平均显著降低(P<0.05)。

2.3 雷公藤多苷对Graves病小鼠氧化应激状态的影响 各组小鼠肝脏组织SOD活性、GSH及MDA水平见表3。结果表明，与对照组相比，模型组小鼠肝脏组织SOD活性、GSH水平均显著降低(P<0.05)，MDA水平显著升高(P<0.05)，与模型组相比，雷公藤多苷各剂量组小鼠肝脏组织SOD活性、GSH水平均显著升高(P<0.05)，MDA水平显著降低(P<0.05)，并呈现出一定的剂量依赖性。

表1 各组小鼠血清TRAb、T4、T3水平(n=6)

表2 各组小鼠血清ALT、AST、ALP水平比较

2.4 雷公藤多苷对Graves病小鼠甲状腺脏器指数的影响 各组小鼠甲状腺脏器指数见表4。结果表明，与对照组相比，模型组小鼠甲状腺脏器指数显著升高(P<0.05)，提示造模成功，与模型组相比，雷公藤多苷低、中、高剂量组Graves病小鼠甲状腺脏器指数均显著降低(P<0.05)，且随着雷公藤多苷剂量的增加，Graves病小鼠甲状腺脏器指数逐渐降低，即表现出剂量依赖性。

2.5 雷公藤多苷对Graves病小鼠甲状腺组织病理学的影响 各组小鼠甲状腺组织病理学检查结果见图1。结果表明，与对照组相比，模型组Graves病小鼠甲状腺组织细胞水肿，可见炎性细胞浸润，滤泡增生肥大，提示造模成功；与模型组相比，雷公藤多苷低、中剂量组Graves病小鼠甲状腺组织细胞水肿减轻，细胞排列较整齐，炎症细胞浸润明显减少，雷公藤多苷高剂量组Graves病小鼠甲状腺组织细胞排列整齐，滤泡上皮细胞增生减轻，偶见炎症浸润。

表4 各组小鼠甲状腺脏器指数

图1 各组小鼠甲状腺组织病理学检查结果(200×)

2.6 雷公藤多苷对Graves病小鼠甲状腺PI3K、AKT、mTOR水平的影响 各组小鼠甲状腺组织细胞PI3K、AKT、mTOR水平见图2。结果表明，与对照组相比，模型组Graves病小鼠甲状腺组织细胞PI3K、AKT、mTOR水平均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，雷公藤多苷各剂量组Graves病小鼠甲状腺组织细胞PI3K、AKT、mTOR水平均显著降低(P<0.05)，并表现出剂量依赖性。

3 讨论

Graves病通常伴有肝脏ALT、AST及ALP等指标水平异常的发生。此外，由于Graves病的全身作用，机体长期处于应激状态，会造成机体自由基生成增加或(和)清除能力降低，导致自由基在体内积累而引起氧化应激损伤，通常表现为肝脏SOD活性及GSH水平降低、MDA水平升高[16]。雷公藤多苷(Tripterygium glycosides)是从卫矛科植物雷公藤根提取精制而成的一种脂溶性混合物，是一种广泛使用的抗炎免疫调节中草药提取物，临床上广泛用于痛风、类风湿性关节炎、原发性肾小球肾病、肾病综合征、紫癜性及狼疮性肾炎、糖尿病肾病等多种疾病。此外，研究表明，其能够调节PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达，发挥抗肿瘤、卵泡修复等作用[9-11]。

图2 各组小鼠甲状腺组织细胞PI3K、AKT、mTOR水平

PI3K/AKT/mTOR通路是一种在调节细胞周期中发挥重要作用的细胞内信号传导途径，由调节细胞生长、细胞存活、细胞周期进程、蛋白质翻译和代谢等多种生理功能的多种细胞刺激激活。PI3K/AKT/mTOR通路的异常激活与胃癌、乳腺癌、肺癌等多种疾病的发生密切相关[17-19]。有研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活与Graves病的发病机制存在一定的关系[2-5]。

本文采用Ad-TSHR 289免疫的方法建立Graves病小鼠模型，研究不同剂量的雷公藤多苷对Graves病小鼠的作用及其对甲状腺组织PI3K/AKT/mTOR通路的影响。结果表明，雷公藤多苷能够呈剂量依赖性地降低Graves病小鼠血清TRAb、T4、T3、ALT、AST及ALP水平，提高小鼠肝脏组织SOD活性及GSH水平，降低肝脏MDA水平，并能够显著降低Graves病小鼠甲状腺脏器指数，改善小鼠甲状腺组织病理学状态，降低Graves病引起的小鼠氧化应激损伤，缓解疾病状态，改善疾病进展及预后。此外，雷公藤多苷能够呈剂量依赖性降低Graves病小鼠甲状腺组织细胞PI3K、AKT、mTOR水平，从而抑制Graves病小鼠甲状腺组织细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常激活，进而缓解Graves病小鼠的疾病进展，改善疾病转归。

综上所述，雷公藤多苷能够改善Graves病小鼠甲状腺功能、氧化应激状态，进而缓解由此引发的肝脏损伤的一系列并发症，其作用机制可能与调节PI3K/AKT/mTOR通路有关。