异丙酚通过调控PI3K/AKT通路对胶质瘤U87细胞增殖、凋亡的影响
2020-08-28李洪军余云明
李洪军,余云明,阳 兴,周 文,李 明
0 引言
脑胶质瘤是一种常见的颅内肿瘤,占颅内肿瘤的45%,发病隐匿,生长速度快,因此常规的手术及放疗等治疗手段效果不甚理想,严重威胁人类生命健康[1]。脑胶质瘤类型为浸润性,主要为低分化的星形细胞瘤、胶质母细胞瘤和间变性星型细胞瘤3类,以胶质母细胞瘤最为常见。胶质瘤与正常脑组织界限不清,因此手术难以进行完全切除;另外,由于其对放化疗并不敏感,因此常在治疗后出现复发,不能对患者起到良好的治疗作用,且伴随的并发症会加重患者痛苦,降低生存质量[2]。异丙酚是临床常用的静脉麻醉药,近年来研究表明,异丙酚除了良好的麻醉效果外,还有较好的抑癌作用,可能抑制乳腺癌[3]、肝癌[4]等恶性肿瘤细胞的生长和侵袭。杨陈祎等[5]研究发现,异丙酚可能影响胶质瘤细胞的生长和凋亡,但具体机制尚不清楚。本研究通过采用不同浓度的异丙酚处理胶质瘤细胞U87,从而探讨其对胶质瘤细胞增殖和凋亡情况的作用及机制,以期为异丙酚用于胶质瘤治疗提供实验数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 胶质瘤U87细胞系购自美国典型培养物保藏中心。
1.1.2 主要试剂与材料 异丙酚购自北京天根生化科技有限公司;胎牛血清、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司;结晶紫、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司;Annexin V细胞凋亡试剂盒购自碧云天生物技术公司;Transwell小室及Matrigel购自美国BioRad公司,本研究所使用的抗体均购自英国Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组 细胞解冻、复苏后培养于含有10%胎牛血清的RMPI 1640培养基内,培养条件为37℃,5% CO2培养箱培养,待细胞融合率达到90%时进行传代培养。参考Liu等[6]方法,异丙酚溶于培养基后,使其终浓度为0.01、0.02、0.05 mmol/L,将研究细胞分为空白对照组(BC组)、P1组(0.01 mmol/L)、P2组(0.02 mmol/L)、P3组(0.05 mmol/L)[7]。
1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖情况 将“1.2.1”项各组培养至对数生长期细胞接种于96孔培养板(4×105个/孔),加入培养基培养48 h,加入CCK-8溶液,培养箱孵育4 h,酶标仪检测吸光度值A(450 nm),细胞增殖率(%)=(研究组A值-空白对照组A值)/(对照孔A值-空白对照组A值)×100%。
1.2.3 平板细胞克隆形成实验检测胶质瘤U87细胞增殖情况 收集“1.2.1”项中培养至对数生长期的U87细胞,胰蛋白酶消化、重悬,梯度稀释后接种至含RPMI 1640培养基的培养皿中(1 000个/皿),分散均匀后置于培养箱常规培养,培养条件为37℃,5% CO2,待出现肉眼可见克隆后,弃去上清,PBS清洗,4%多聚甲多醛固定,0.5%结晶紫染色,20 min后,洗去染色液,空气干燥。计算4组细胞克隆形成率。克隆形成率=(形成克隆数目/接种细胞数目)×100%。
1.2.4 细胞凋亡情况检测 收集“1.2.1”项细胞,胰蛋白酶消化,接种于96孔板(5.0×104个/孔)培养,48 h后收集细胞,洗涤细胞,4 ℃离心后重悬,加入PI及Annexin-V-FITC混合均匀,37 ℃反应20 min,加入缓冲液,检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。
1.2.5 划痕实验检测细胞迁移情况 将“1.2.1”项下培养至对数生长期细胞接种至96孔培养板(4×105个/孔),待细胞长满底部,利用灭菌枪头在玻片底部培养基划痕,PBS冲洗划下的细胞,利用含有不同浓度异丙酚的无血清培养基培养细胞,记录0 h、48 h细胞划痕宽度。倒置显微镜观察细胞迁移率=(研究组划痕缩小宽度/对照组划痕缩小宽度)×100%。
1.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭情况 待“1.2.1”项中各组细胞消化离心,PBS清洗后重悬,将其以1×105/ml的密度接种于Transwell小室上层,利用含有不同浓度异丙酚的无血清培养基培养,Transwell小室上层加入基质胶Matrigel,下室预先加入500 μl含10%胎牛血清的培养基,培养箱内培养24 h,无水甲醇固定10 min。结晶紫染色,随机取6个视野显微镜下拍照(400×),计数发生侵袭的细胞数量。
1.2.7 Western blot法检测相关蛋白 收集“1.2.1”项中各组细胞,提取总蛋白,利用Western blot法检测Ki67、基质金属蛋白酶(Matrix metallopeptidase,MMP)9、Caspase-9、3-磷酸肌醇激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、磷酸化-PI3K(p-PI3K)、蛋白质丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Protein-serine-threonine kinase,AKT)、磷酸化-AKT(p-AKT)相对表达量。
2 结果
2.1 U87细胞增殖检测结果 不同浓度异丙酚处理后,P1、P2、P3组胶质瘤U87细胞增殖率低于BC组(P<0.05)。随着异丙酚浓度升高,U87细胞增殖率显著降低(P<0.05)。见图1。
2.2 平板克隆检测结果 P1、P2、P3组U87细胞平板克隆形成率低于对照组(P<0.05),P3组显著低于 P1和P2组(P<0.05)。见图2。
图1 细胞增殖检测结果
图2 平板克隆检测结果
2.3 U87细胞凋亡检测结果 不同浓度异丙酚处理后,P1、P2、P3组胶质瘤U87细胞凋亡率较对照组显著升高(P<0.05),随着异丙酚浓度升高,U87细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图3。
2.4 U87细胞迁移、侵袭检测结果 不同浓度异丙酚处理后,P1、P2、P3组胶质瘤U87细胞迁移率、侵袭细胞数降低(P<0.05),随着异丙酚浓度升高,U87细胞迁移率、侵袭细胞数降低(P<0.05)。见图4、图5。
2.5 增殖、凋亡及侵袭相关蛋白表达情况 不同浓度异丙酚处理后,P1、P2、P3组细胞Ki67、MMP-9蛋白表达量降低(P<0.05),且随异丙酚浓度升高,表达量逐渐降低(P<0.05);Caspase-9蛋白表达量升高(P<0.05),随异丙酚浓度升高,表达量逐渐升高(P<0.05)。见图6。
图3 细胞凋亡检测结果
图4 异丙酚处理后各组U87细胞迁移检测结果
2.6 PI3K/ATK信号通路相关蛋白表达情况 不同浓度异丙酚处理后,P1、P2、P3组细胞p-PI3K、p-ATK蛋白表达量显著降低(P<0.05),且随异丙酚浓度升高,p-PI3K、p-ATK蛋白表达量逐渐降低(P<0.05);PI3K、ATK蛋白表达量无显著变化(P>0.05)。见图7。
图5 异丙酚处理后各组U87细胞侵袭检测结果
图6 Western blot检测增殖及凋亡相关蛋白表达
3 讨论
目前,胶质瘤常用的治疗方式为手术切除,但术后患者复发率较高,且术后并发症极大地增加了患者的痛苦。因此,在围手术期减轻患者痛苦的基础上,有效控制胶质瘤细胞转移和术后病情复发已成为当前研究热点。
麻醉药可在肿瘤切除手术中缓解疼痛,抑制机体应激反应,进而激活神经内分泌,抑制自然杀伤细胞,但同时也具有抑制免疫功能的作用,因此,近年来,人们开始注意到麻醉药对肿瘤细胞的作用。异丙酚是肿瘤患者术中常用的静脉麻醉药之一,因其用药量少,麻醉时间长等优点而被广泛应用[8]。近年研究发现,异丙酚具有明显的抗癌作用,可通过调控多种信号传导途径及miRNA,进而抑制肿瘤细胞增殖及侵袭[9-10]。Zhang等[11-12]研究结果表明,1~5 μg/ml的异丙酚可抑制宫颈癌HeLa细胞、骨肉瘤HOS细胞系的侵袭能力。在不同肿瘤中,异丙酚可通过不同作用机制发挥作用。有报道显示,异丙酚可通过间接抑制整合素聚集及激动蛋白应力纤维形成而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用[11]。另有研究表明,异丙酚可显著提高肝癌细胞HepG2中miR-199a表达,从而抑制肝癌细胞侵袭[12]。本研究结果显示,不同浓度异丙酚处理后,P1、P2、P3组胶质瘤U87细胞增殖率较BC组均显著降低,随着异丙酚浓度升高,U87细胞增殖率显著降低,凋亡率显著升高,侵袭及迁移能力降低,提示异丙酚可能具有抑癌作用,与Cui等[13]研究结果一致。
图7 Western blot检测PI3K/ATK信号通路相关蛋白表达
肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭与癌症的发生发展有关,在正常生理状态下,细胞增殖与凋亡处于动态平衡,在癌症中,该平衡被打破。而细胞侵袭是癌症发生发展的前提,与肿瘤侵犯周围组织有关。PI3K/AKT通路与癌细胞的增殖、凋亡及侵袭有关,PI3K作为原癌基因可激活磷脂酰肌醇及肌醇,可激活下游的Akt,使其磷酸化为p-Akt,进而激活或抑制下游基因表达,参与癌细胞的增殖、凋亡及侵袭[14-16]。本研究结果显示,不同浓度异丙酚处理后,P1、P2、P3组胶质瘤U87细胞中p-PI3K、p-ATK蛋白低表达,PI3K、AKT蛋白无显著差异,且呈浓度依赖性,提示异丙酚可能抑制胶质瘤U87细胞中PI3K/AKT通路激活。研究表明,p-AKT可磷酸化Caspase-9基因196位丝氨酸位点,抑制其促凋亡作用[17]。MMP-9是基质金属蛋白酶家族成员,可降解细胞外基质,破坏基底膜的完整性,促进肿瘤侵袭和转移。王佳等[18]研究发现,MMP-9可能参与胶质瘤细胞侵袭,与脑胶质瘤发生发展有关。而PI3K/AKT通路可能通过影响MMP-9蛋白表达参与调控肿瘤细胞侵袭。Ki67与细胞增殖密切相关,是常见的肿瘤增殖标志物,与胶质瘤细胞异常增殖有关[19]。本研究结果表明,不同浓度异丙酚处理后,P1、P2、P3组胶质瘤U87细胞中Ki67、MMP-9蛋白表达量降低,Caspase-9蛋白高表达,提示异丙酚可能通过抑制PI3K/AKT通路激活,进而抑制胶质瘤U87细胞增殖,促进凋亡,抑制细胞侵袭能力。
综上所述,异丙酚可能通过抑制胶质瘤U87细胞PI3K/AKT通路激活,进而抑制细胞增殖,促进凋亡,抑制细胞侵袭、迁移能力。