RP-HPLC法同时测定五味清浊散中3种成分的含量

李 柯，杨 蕾，孟令嘉，刘 炜

0 引言

五味清浊散系蒙古族验方，由石榴、红花、豆蔻、肉桂、荜茇五味药材经粉碎、过筛、混合等工艺加工制成的中药散剂，具有开郁消食、暖胃等功效，临床主要用于治疗食欲不振、消化不良、胃脘冷痛、腹胀泄泻等病症[1-5]；方中红花有活血通经、散瘀止痛等功效[6-10]，肉桂有补火助阳、引火归元、散寒止痛、温通经脉等功效[11-14]，荜茇有温中散寒、下气止痛等功效[15-19]；五味清浊散收载于《中国药典》2015年版中，产品各论中无含量测定项[20]，不能较好地显示药品的质量水平和保障广大患者的用药安全。本研究建立RP-HPLC法同时测定五味清浊散中活性成分山柰素、桂皮醛和胡椒碱含量的分析方法，试验证明方法具有快速、简便、准确等特点，适用于五味清浊散产品的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters Alliance E2695型高效液相色谱仪，配备2998二极管阵列检测器(沃特世科技公司)；Agilent zorbax XDB-C18色谱柱(安捷伦科技公司，250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；Mettler toledo XS-204DU型电子天平(梅特勒-托利多科技公司)；KQ 3200D型超声仪(昆山超声设备公司)；Milli-Q A10型超纯水处理系统(密理博科技公司)。

1.2 试药 五味清浊散(规格：每袋装3 g，批号：20181106、20190409、20190715，阜新蒙药有限责任公司生产)；对照品：山柰素(批号：110861-201812，含量以93.8 %计)；桂皮醛(批号：110710-201821，含量以99.6%计)；胡椒碱(批号：110775-201706，含量以98.9%计)，均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇：HPLC级，购自德国默克公司；浓磷酸：优级纯，购自国药集团；纯化水：自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax Extend C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，4.5 μm)；检测波长：319 nm；流速：1.0 ml/min；流动相：流动相A(乙腈)-流动相B(0.5%磷酸溶液)，梯度洗脱，洗脱程序：0～5 min 17%A，5～21 min 17%～43%A，21～29 min 43%～74%A，29～30 min 74%～17%A，30～35 min 17%A；进样量：20 μl；柱温：30 ℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合对照品储备溶液 取山柰素对照品26.65 mg、桂皮醛对照品25.10 mg、胡椒碱对照品25.28 mg，精密称定，置于25 ml量瓶中，加75%甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀。

2.2.2 对照品溶液 精密量取“2.2.1”混合对照品储备溶液1.0 ml，置于50 ml量瓶中，加75%甲醇溶液定容至刻度，摇匀。

2.2.3 供试品溶液 取五味清浊散样品，研钵研成细粉，混匀；取研细后的粉末1.0 g，精密称定，置于25 ml量瓶中，加75%甲醇溶液20 ml，超声提取20 min(功率180 W，频率75 kHz)，取出放至室温，加75%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 阴性供试品溶液 按五味清浊散药材配比比例和加工制备方法，制备缺红花、肉桂和荜茇的阴性样品，阴性供试品按“2.2.3”方法进行处理，得阴性供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取“2.2.2”对照品溶液、“2.2.3”供试品溶液和“2.2.4”阴性供试品溶液，按“2.1”色谱条件，待系统稳定后分别进样分析，记录色谱图；结果山柰素、桂皮醛和胡椒碱3种活性成分在该色谱条件下，分离度均大于1.5，理论塔板数均不低于5 000，符合要求，且阴性供试品溶液中无干扰峰。典型谱图见图1。

图1 HPLC图

2.3.2 线性关系考察 取“2.2.1”混合对照品储备溶液适量，制备含山柰素、桂皮醛和胡椒碱浓度分别为0.3、0.6、1.0、3.0、6.0、10.0、15.0 μg/ml的标准曲线溶液，加75%甲醇溶液定容至刻度，摇匀；按“2.1”色谱条件，待系统稳定后分别进样分析，记录色谱图；以3种活性成分响应峰面积为纵坐标(Y)、对应浓度为横坐标(X)进行线性回归，结果3种活性成分在0.3～15.0 μg/ml浓度范围内，具有良好的线性。结果见表1。

2.3.3 重复性试验 取五味清浊散样品(规格：3 g/袋，批号：20181106)，按“2.2.3”供试品溶液前处理方法制备供试品溶液，同法共制备6份供

表1 山柰素、桂皮醛和胡椒碱线性方程、相关系数及线性范围

试品溶液；按“2.1”色谱条件，待系统稳定后分别进样分析，记录色谱图，以3种成分含量计算相对标准偏差(RSD)；结果山柰素、桂皮醛和胡椒碱含量RSD分别为3.5%、4.2%和2.8%，表明方法重复性良好。

2.3.4 精密度试验 取“2.2.2”对照品溶液，按“2.1”色谱条件，待系统稳定后进样分析，连续进样6针，记录色谱图，按山柰素、桂皮醛和胡椒碱峰面积计算RSD；结果山柰素、桂皮醛和胡椒碱精密度RSD分别为2.1%、2.3%、1.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 取五味清浊散样品(规格：3 g/袋，批号：20181106)，按“2.2.3”供试品溶液前处理方法制备供试品溶液，室温下分别放置0、1、3、6、9、18、24 h，每个时间点取样1次，按“2.1”色谱条件，待系统稳定后分别进样分析，记录色谱图，以3种成分峰面积计算RSD；结果山柰素、桂皮醛和胡椒碱峰面积RSD分别为2.2%、1.9%、1.3%，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.3.6 加样回收率试验 取已测定含量的五味清浊散样品(规格：3 g/袋，批号：20181106)，研钵研成细粉，混匀；取研细后的粉末1.0 g，精密称定，置于25 ml量瓶中，分别加入“2.2.1”混合对照品储备溶液一定量，后续按“2.2.3”供试品溶液处理，同法共制备6份样品加标溶液；按“2.1”色谱条件，待系统稳定后分别进样分析，记录色谱图，计算山柰素、桂皮醛和胡椒碱加样回收率结果。结果见表2。

表2 样品加标回收率结果

2.4 市售样品含量测定 取市售五味清浊散样品(规格：3 g/袋，批号：20181106、20190409、20190715，阜新蒙药有限责任公司)样品，按“2.2.3”供试品溶液处理，得供试品溶液；按“2.1”色谱条件，待系统稳定后分别进样分析，记录色谱图，根据峰面积计算山柰素、桂皮醛和胡椒碱的含量结果。见表3。

3 讨论

3.1 检测波长选择 取山柰素对照品、桂皮醛对照品和胡椒碱对照品，分别配制6.0 μg/ml的标准溶液，在190～600 nm范围内进行全波长扫描，结果山柰素、桂皮醛和胡椒碱分别在365 nm、292 nm和343 nm处有最大吸收，为使3种活性成分在“2.1”色谱条件下响应良好，故选择319 nm作为检测波长，试验证明，选择该波长，3种活性成分响应良好，检测结果准确。

表3 样品含量检测结果

3.2 流动相选择 分别选择乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.5%磷酸溶液和甲醇-0.5%磷酸溶液作为流动相体系，考察不同体系对3种成分分离的影响；按“2.1”色谱条件，保持其他条件不变，分别采用上述4种流动相体系，考察3种活性成分分离情况。因此，选择乙腈-0.5%磷酸溶液作为流动相体系时，山柰素、桂皮醛和胡椒碱分离度最佳，且阴性对照溶液无干扰。

综上所述，研究建立采用RP-HPLC法同时测定五味清浊散中活性成分山柰素、桂皮醛和胡椒碱含量的分析方法，可以用于五味清浊散中活性成分山柰素、桂皮醛和胡椒碱含量的测定。