厄贝沙坦对肾缺血再灌注损伤小鼠细胞凋亡的影响及其机制

刘 华，冯 玉，杨 静，张瑞城

0 引言

肾缺血再灌注损伤(Renal ischemic reperfusion injury，RIRI)是急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)的最主要原因，RIRI后氧自由基的富集，炎症反应的激活，都可以诱发肾小管上皮细胞损伤，出现AKI特征性的病变[1-2]。肾素-血管紧张素系统(RAS)在急慢性肾损伤发病机制中发挥着重要的作用[3]，厄贝沙坦是一种高选择性血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)受体拮抗药[4]，可以显著扩张肾小球出球小动脉，降低肾小球内压，降低尿蛋白，对患者肾功能发挥保护作用[5]。本研究用夹闭小鼠肾动脉的方法建立RIRI动物模型，在此基础上观察厄贝沙坦对RIRI小鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 厄贝沙坦为法国赛诺菲(杭州)制药有限公司生产(批号：1822156)，血肌酐(Creatinine，Cr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)检测试剂盒购自瑞士Roche公司，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)检测试剂盒购自南京建成生物技术公司，肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(Interleukin，IL)-6、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司，P65和Histone抗体购自美国Abcam公司。BX53MRF-S显微镜购自日本奥林巴斯公司，Cobas Integra 800全自动生化分析仪购自瑞士Roche公司。

1.2 实验动物 60只清洁级健康雄性C57/BL小鼠购自海南医学院动物实验中心[动物生产许可证号：SCXK(琼)2017-0012]，6～8周龄，体重20～30 g，清洁级环境下自由进水和食物，适应性饲养7 d后，进行分组实验。使用数字表法将60只小鼠随机分为4组：假手术组、RIRI组、低剂量厄贝沙坦组(10 mg/kg，低剂量组)、高剂量厄贝沙坦组(20 mg/kg，高剂量组)，每组15只。

1.3 RIRI小鼠动物模型的建立 所有小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，背部皮肤消毒，切开腰背筋膜，分离肾周围组织，暴露双侧肾脏，无创动脉夹阻断双侧肾动脉后发现肾脏组织变白，继续阻断45 min后松开无创动脉夹，肾灌注良好后分层缝合切口，最后缝合皮肤，术后12 h断颈处死所有小鼠，取心脏血液和肾脏组织进行相关检测。假手术组仅暴露肾脏，不阻断肾动脉，RIRI组、低剂量组、高剂量组进行肾动脉阻断造模处理，低剂量组、高剂量组在造模前3 d给予10、20 mg/kg厄贝沙坦灌胃，1次/d。

1.4 Cr、BUN、SOD、MDA、TNF-α、IL-6的检测 小鼠断颈处死后快速提取小鼠心脏血液送检验科，邻苯三酚法测定SOD，硫代巴比妥酸法检测MDA，ELISA检测Cr、BUN、TNF-α和IL-6，严格按照试剂盒说明书操作，使用全自动生化分析仪完成检测。

1.5 TUNEL细胞凋亡检测 小鼠断颈处死后取出肾脏组织，4%福尔马林溶液固定，送交病理科制作组织蜡块，4 μm厚切片后，脱蜡以及梯度乙醇脱水，蛋白酶K[10 μg/ml，0.1-M Tris，50 mM EDTA(pH 8)]渗透消化组织，室温15 min，末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)反应缓冲液处理10 min，37 ℃加入TDT反应混合物60 min，最后3，3’-二氨基联苯胺(DAB)反应显色，苏木精复染。棕褐色着色为凋亡阳性细胞，每高倍镜(200×)下随机选取5个视野计算肾小管上皮细胞凋亡指数(Apoptosis index，AI)，AI=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.6 Western blot检测 小鼠断颈处死后取出肾脏组织，取50 mg组织，液氮下研磨，加入胰蛋白酶消化细胞制造单细胞悬液，置冰上水中裂解细胞膜30 min，10 000 g离心20 min，取沉淀物加入细胞核裂解液作用20 min，离心后取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉浸PVDF膜1 h，加入P65(1∶1 000)和Histone(1∶5 000)抗体，4 ℃孵育过夜后加入二抗，X-ray曝光显色目的条带，对照内参Histone计算各组P65蛋白的相对灰度值。

1.7 统计学处理 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，多组均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 厄贝沙坦对RIRI小鼠肾功能的影响 假手术组、RIRI组、低剂量组、高剂量组Cr和BUN组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中低剂量组和高剂量组Cr和BUN显著低于RIRI组(P<0.05和P<0.01)，高剂量组Cr和BUN显著低于低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 四组小鼠Cr和BUN比较

2.2 厄贝沙坦对RIRI小鼠氧化应激以及炎症反应的影响 假手术组、RIRI组、低剂量组、高剂量组MDA、SOD、TNF-α和IL-6组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中低剂量组和高剂量组MDA、TNF-α和IL-6显著低于RIRI组，SOD显著高于RIRI组(P<0.05和P<0.01)，而高剂量组MDA、TNF-α和IL-6显著低于低剂量组，SOD显著高于低剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 四组小鼠SOD、MDA、TNF-α和IL-6比较

2.3 厄贝沙坦对RIRI小鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响 假手术组、RIRI组、低剂量组、高剂量组AI分别为0.34%±0.05%、32.14%±3.46%、22.32%±3.17%和14.06%±1.53%，四组间比较差异有统计学意义(F=14.317，P<0.01)，其中低剂量组和高剂量组AI显著低于RIRI组(P<0.01)，而高剂量组AI显著低于低剂量组(P<0.01)。见图1。

图1 小鼠TUNEL细胞凋亡染色(200×)

2.4 厄贝沙坦对RIRI小鼠NF-κB通路的影响 假手术组、RIRI组、低剂量组、高剂量组细胞核P65蛋白的相对灰度值分别为0.06±0.01、0.52±0.09、0.27±0.04和0.16±0.03，四组间比较差异有统计学意义(F=13.426，P<0.01)，其中低剂量组和高剂量组细胞核P65蛋白相对灰度值显著低于RIRI组(P<0.01)，而高剂量组细胞核P65蛋白相对灰度值显著低于低剂量组(P<0.01)。见图2。

图2 小鼠P65蛋白的Western blot检测

3 讨论

临床上约47%的AKI是由RIRI引起。RAS紊乱是肾损伤的主要途径之一[6]。RAS紊乱可通过Ang Ⅱ 1型受体的直接作用导致肾小管损伤，临床上给糖尿病肾病患者早期使用AngⅡ受体抑制药物厄贝沙坦，可以延缓肾功能的恶化[7]。本研究发现，低剂量组和高剂量组Cr和BUN显著低于RIRI组，而高剂量组Cr和BUN显著低于低剂量组，说明厄贝沙坦可以拮抗RIRI的肾损伤，而且呈剂量依赖关系。

RIRI激发的氧化应激和炎症反应是肾损伤的关键环节，研究显示，抗氧化抗炎可以保护RIRI肾损伤[8]。李贵荣等[9]研究显示，下调血管紧张素Ⅱ可以抑制大鼠肝脏缺血再灌注损伤。Kabel等[10]研究显示，厄贝沙坦可以抑制氧化应激和炎症反应，保护阿霉素诱导的肝损伤，MDA、SOD、TNF-α和IL-6是常用的氧化应激炎症监控指标，本研究显示，低剂量组和高剂量组MDA、TNF-α和IL-6显著低于RIRI组，SOD显著高于RIRI组，而高剂量组MDA、TNF-α和IL-6显著低于低剂量组，SOD显著高于低剂量组，表明厄贝沙坦可以抑制RIRI小鼠的氧化应激和炎症反应。NF-κB是体内氧化应激和炎症反应的重要调节通路，通路激活后P65蛋白入核发挥转录因子的作用，调节下游基因的表达，促进氧化炎症反应以及细胞凋亡[11]。研究显示，抑制NF-κB通路可以保护RIRI肾功能[12]。本研究显示，低剂量组和高剂量组细胞核P65蛋白相对灰度值显著低于RIRI组，高剂量组细胞核P65蛋白相对灰度值显著低于低剂量组，说明厄贝沙坦可以剂量依赖性地抑制RIRI小鼠NF-κB通路激活。细胞凋亡分析也显示，低剂量组和高剂量组AI低于RIRI组，高剂量组AI低于低剂量组，说明厄贝沙坦可以剂量依赖性地抑制RIRI小鼠肾小管上皮细胞的凋亡，对肾脏的保护作用可能是通过抑制NF-κB通路实现的。

综上所述，厄贝沙坦可以抑制RIRI小鼠NF-κB通路激活，抑制氧化炎症反应，抗肾小管上皮细胞凋亡，发挥RIRI损伤的肾脏保护作用。