芒柄花素介导结肠癌细胞的凋亡作用

刘金星，李星辰，陈玉，卢海燕

（桂林医学院临床医学院，广西 桂林）

0 引言

结肠癌(Colorectal cancer,CRC)已成为最常见的消化道恶性肿瘤之一, 其发病率和死亡率均居全球前列，并呈上升趋势, 在我国, 结肠癌死亡率已位于恶性肿瘤死亡率的第五位[1], 严重影响人类健康和正常生活,目前国际上针对此结肠癌的治疗手段主要以手术为主的综合治疗，但效果不理想，有研究表明结肠癌病人5年生存率为65.1%[2]，仍未达到期望值，并且传统治疗手段花费高，大部分家庭无力负担。因此，探明药物介导结肠癌细胞凋亡的分子机制，寻找一种高效低毒的药物具有重要临床意义。现代药理学研究表明芒柄花素（formononetin)具有良好的抗肿瘤等作用[3]，本实验拟通过不同浓度的芒柄花素（0、50、75、100μmol /L）分别作用于结肠癌RKO细胞株，观察结肠癌RKO细胞MMP1、VEGFA、PPP2R2A蛋白水平变化，探讨芒柄花素诱导结肠癌细胞的凋亡机制，结果报告如下。

1 主要仪器和试剂

结肠癌RKO细胞(桂林医学院基础医学院实验室），98%芒柄花素（方西安云悦生物科技有限公司），Eppendorf Centrifuge 5810离 心 机,CDW-86L328超 低温冰箱，Eppendorf 超净台，美国伯乐垂直电泳仪Mini-PROTEA，MMP1、VEGFA、PPP2R2A抗体（碧云天生物科技有 限 公 司），PageRuler prest Protein Ladder，5级 WESTAR SUPERNONV，-20度冰箱，伯乐超灵敏多功能化学发光成像系统ChemiDoc Touch，塞默细胞培养箱。

2 实验方法

2.1 细胞培养

使用培养液将细胞数调整为（2-5）×109cell/mL，将细胞置于含10% 胎牛血清（购自合肥博美生物公司）和1%青霉素的1640培养基后在含5%CO2的37℃培养箱中常规培养传代，以上均为无菌操作。

2.2 采用Western blot法检测RKO细胞蛋白表达

用不同浓度芒柄花素处理RKO细胞48h，提取总蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品蛋白浓度，以 3: 1 体积比与SDS-PAGE上样缓冲液混合，置于-80度冰箱保存，配制好SDS-PAGE凝胶后上样，调浓缩胶电泳电压为80V、1h，分离胶为 120 V、1.5h，电泳完成后转膜 2h，常规操作后加入 MMP1、VEGFA、PPP2R2A抗体（抗体稀释度1：500）4 ℃缓慢摇晃孵育过夜，用TBST溶液洗PVDF膜 5 min×3次，羊抗鼠二抗（抗体稀释度1：400）室温孵育1h，用TBST溶液洗PVDF膜 5 min×3次，使用化学发光液A、B按1：1的比例混合均匀后，均匀涂抹于PVDF膜上，放置于化学发光仪，使用凝胶分析系统记录并保存结果。

2.3 统计分析

3 结果

RKO细胞凋亡相关蛋白（MMP1蛋白、VEGFA、PPP2R2A蛋白）的表达情况。Western blot结果显示，对照组、实验组50、75、100μmol /L芒柄花素RKO细胞MMP1蛋白表达水平为呈下调趋势；VEGFA蛋白表达水平为同样呈下调趋势，PPP2R2A蛋白表达水平为呈上调趋势。

芒柄花素对MMP1、VEGFA、PPP2R2A蛋白表达水平的影响（见下图）Wester blot结果表明，与对照组相比实验组50、75、100μmol/L芒柄花素RKO细胞蛋白表达分别：MMPI：（1.324±0.034）、（1.219±0.028）、（0.923±0.037）、（0.436±0.029）；（0.639±0.025）、（0.462±0.031）、34）、（0.517±0.022）、（1.218±0.0313）。对照组相比，实验组MMP1蛋白水平、VEGFA蛋白水平下调，PPP2R2A蛋白水平上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图1

4 实验分析

凋亡是活体内局部组织中单个细胞程序性细胞死亡的表现形式，细胞凋亡机制在细胞的发生发展过程中起着至关重要的作用，一旦细胞凋亡机制失去作用，细胞生长失控就会演变成癌细胞，在当今以手术治疗结肠癌为主特别是晚期结肠癌效果不佳的背景下，细胞凋亡机制成为结肠癌基因治疗的热点。芒柄花素存在于豆类植物红车轴草的花序及带花枝叶，刺芒柄花全草中，有研究发现芒柄花素对结肠癌[4]、乳腺癌[5]、膀胱癌[6]、鼻咽癌[7]等多种肿瘤细胞的生长均有不同程度的抑制作用。本实验将不同浓度的芒柄花素作用于RKO细胞，观察在细胞凋亡机制中的某些蛋白（MMP1、VEGFA、PPP2R2A）的表达情况，进而探讨其对结肠癌细胞增殖的介导作用。

间质胶原酶（MMP1）作为MMPs家族的其中一类，能够降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，参与机体生理及病理过程，与多种癌变有关，有研究证明，MMP1几乎在所有类型的癌症中均能表达，且其高表达往往预示着预后不良[8-10]，王大平等研究发现TIMPs能够限制骨肿瘤向周围组织浸润和侵袭，可能与其抑制MMP1的活性有关。[11]。实体恶性肿瘤的发生发展过程中离不开新血管的生成[8]，结肠癌作为实体恶性肿瘤的一类其发生发展过程自然也离不开血管的供应，研究发现VEGFA过表达能够有效的刺激新血管的产生[13],某些抗肿瘤药物可以通过下调VEGFA蛋白水平抑制肿瘤血管的生成从而发挥抗肿瘤效果，姚子涵等研究发现蟾毒灵可通过抑制血管内皮细胞生成，抑制裸鼠人结肠癌移植瘤瘤体的生长，可能与下调VEGFA蛋白水平有关[14]。本实验Western blot结果显示MMP1、VEGFA蛋白水平均下调，且成浓度依赖性。

近年来有研究发现PPP2R2A作为细胞凋亡通中的作用靶点与多种恶性肿瘤的发生发展过程有关，Wei Zhao研究发现miR-556-5p通过抑制PPP2R2A的表达参与前列腺癌的发生[15]；Zhang Jing发现miR-614通过靶向PPP2R2A促进卵巢癌细胞增殖[16]；Wen Long Liang发现过表达miR-892a可能通过直接抑制PPP2R2A的表达选择性的促进结直肠癌细胞的增殖[17]，但药物对PPP2R2A蛋白的直接调节作用却鲜有报道。本实验通过检测PPP2R2A蛋白表达水平发现，结果呈上调趋势，推测芒柄花素可能激活了细胞凋亡机制，促进了RKO细胞凋亡

5 实验结论

综上，本实验得出结论：芒柄花素可抑制结肠癌细胞增殖，介导其凋亡，可能与下调MMP1、VEGFA蛋白水平，上调PPP2R2A蛋白水平，激活细胞凋亡机制有关。