弹力纤维染色在结直肠癌脏层腹膜弹力层侵犯及血管侵犯中的应用价值及临床意义

于雪姣 张芳 周磊

[摘要] 目的 探討弹力纤维染色在判断结直肠癌脏层腹膜弹力层侵犯和血管侵犯中的应用价值及临床意义。方法 选取2013年1月～2016年12月山东省青岛市市立医院结直肠癌组织学标本75例，采用常规HE染色和地衣红弹力纤维染色的方法观察标本中的脏层腹膜侵犯、脏层腹膜弹力层侵犯和血管侵犯情况，并观察与淋巴结转移、血管侵犯、神经侵犯及肿瘤出芽之间的关系。 结果 弹力纤维染色脏层腹膜弹力层肿瘤侵犯的检出率高于HE染色的检出率，差异有统计学意义（P < 0.05）;脏层腹膜弹力层侵犯阳性患者其淋巴结转移、静脉侵犯及肿瘤出芽发生率高于脏层腹膜弹力层侵犯阴性的患者，差异有统计学意义（P < 0.05）;脏层腹膜弹力层侵犯阳性患者其神经侵犯发生率高于脏层腹膜弹力层不存在的患者，差异有统计学意义（P < 0.05）;弹力纤维染色血管侵犯检出率高于HE染色，差异有统计学意义（P < 0.05），其特异性为100.0%，敏感性为65.8%。 结论 弹力纤维染色能够明显提高结直肠癌的脏层腹膜弹力层侵犯和血管侵犯检出率，脏层腹膜弹力层侵犯阳性的患者提示肿瘤预后不良，脏层腹膜弹力层侵犯可能作为结直肠癌分期的临床病理指标之一。

[关键词] 癌;结直肠;脏层腹膜;弹力层侵犯;血管侵犯

[中图分类号] R365          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）07（a）-0024-04

[Abstract] Objective To explore the application value and clinical significance of elastica staining in identifying visceral peritoneal elastic lamina invasion and vascular invasion of colorectal cancer. Methods From January 2013 to December 2016， 75 colorectal cancer histological specimens were selected from Qingdao Municipal Hospital， the peritoneal invasion of the visceral layer， the peritoneal invasion of the visceral layer and the vascular invasion in the specimens were observed by conventional HE staining and lichen red elastic fiber staining. The relationship among lymph node metastasis， vascular invasion， nerve invasion and tumor budding were observed. Correlations between visceral peritoneal elastic lamina invasion and lymph metastasis， vascular invasion， perineural invasion， tumor budding were also investigated. Results Elastic fiber staining results showed the positive rate of visceral peritoneal elastic lamina invasion was higher than that of HE staining， and the difference was statistically significant （P < 0.05）; the incidence of lymph metastasis， vascular invasion and tumor budding in visceral peritoneal elastic lamina invasion positive cases were higher than those in peritoneal elastic lamina invasion negative cases， the differences were statistically significant （P < 0.05）; the incidence of nerve invasion in patients with positive visceral peritoneal elastic layer invasion was higher than that in patients without visceral peritoneal elastic layer invasion， and the difference was statistically significant （P < 0.05）; elastic fiber staining revealed that the detection rate of vascular invasion was higher than HE staining， and the difference was statistically significant （P < 0.05）， and with 100.00% specificity and the 65.8% sensitivity. Conclusion Elastic fiber staining can significantly improve the detection rate of visceral peritoneal elastic layer invasion and vascular invasion. Patients with positive visceral peritoneal elastic layer invasion suggest poor tumor prognosis， and visceral peritoneal elastic layer invasion may be one of the clinicopathological indicators for colorectal cancer staging.

[Key words] Cancer; Colorectum; Visceral peritoneal; Elastic lamina invasion; Vascular invasion

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是人类高发恶性肿瘤，相关数据显示我国结直肠癌发病率在全部恶性肿瘤中居第5位，死亡/发病比为50.8%[1]。脏层腹膜侵犯（visceral peritoneal invasion，VPI）是结直肠癌术后病理分期（pTNM）及临床个体化治疗的重要指标。在实际临床病理工作中，VPI的判定主要依据HE染色的镜下观察，由于肿瘤组织破坏腹膜结构，周围胶原纤维增生及炎性反应易导致脏层腹膜侵犯的低诊断，因此能否找到客观性判读指标是结直肠癌病理分期中需要解决的重要问题。血管侵犯（vascular invasion，VI）是结直肠癌Ⅰ类预后因子[2-3]，是评估远处转移、肿瘤预后和疗效预测的重要指标[4-6]，HE染色镜下观察和免疫组化染色均可造成假阴性结果。本研究通过弹力纤维染色检测结直肠癌组织中脏层腹膜弹力层侵犯（visceral peritoneal elastic lamina invasion，VPELI）和VI的发生率，并观察与淋巴结转移、VI、神经侵犯、肿瘤出芽之间的关系，考察弹力纤维染色以及VPELI在结直肠癌临床病理分期中的应用价值及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月～2016年12月山东省青岛市市立医院（以下简称“我院”）手术切除结直肠癌标本75例，所有病例均未接受术前放化疗等辅助治疗，经术后组织病理学检查明确诊断。其中男42例，女33例;年龄40～87岁，平均（64.7±7.4）岁;病变位于结肠40例，直肠35例;溃疡型68例，隆起型7例;其中高分化腺癌1例，中分化腺癌60例，低分化腺癌14例;pT3期56例，pT4a期19例;肿瘤直径3.0～7.4 cm，平均（4.60±0.73）cm，伴有淋巴结转移者29例。实验方案均经我院医学伦理委员会研究通过，所有患者签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 HE染色  标本经10%中性甲醛固定6～24 h，常规脱水，石蜡包埋，每个蜡块4～5 μm切片，30 min烤片后，二甲苯脱蜡至水，苏木精染色3～5 min，水洗，伊红染色2～3 min，水洗，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。

1.2.2 试剂配制  1%地衣红染液：1 g地衣红（上海源叶生物科技公司，S19015-5g）溶于99 mL 70%乙醇，然后加入1 mL浓盐酸，震荡、过滤，4℃冰箱中保存备用。苦味酸饱和水溶液：2 g苦味酸粉末（上海源叶生物科技公司，S25563-25g）溶于100 mL水中，室温中保存备用。1%酸性品红水溶液：1 g酸性品红（上海源叶生物科技公司，S19025-25g）溶于100 mL蒸餾水中，室温中保存备用。

1.2.3 弹力纤维染色  采用地衣红染色法，具体步骤如下：石蜡包埋组织3～4 μm切片后脱蜡至水，放置70%酒精中清洗后置于1%地衣红染液中过夜，70%酒精充分洗涤30 s，95%酒精分化至显微镜下观察到弹力纤维显色，放到苦味酸品红混合液中（1∶30，现用现配）复染1 min，95%酒精中脱水分化3 min，二甲苯透明，封片。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，计数资料用例数表示，组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VPELI及VI弹力纤维染色形态学判读

弹力染色呈现鲜亮的红棕色，可清晰显示脏层腹膜弹力层（图1A，见封四）及血管管壁的弹力纤维（图1B，见封四）。VPELI判读标准：①肿瘤组织明确超过脏层腹膜弹力层（图1C，见封四）;②肿瘤组织致弹力层不清晰时，肿瘤组织位于附近残存脏层腹膜弹力层水平线之上。VI的形态学识别包括：①在单个动脉附近存在弹力纤维包绕界限清晰的肿瘤结节，且没有明显的静脉（图1D，见封四）;②围绕肿瘤的同心圆状的弹力纤维（图1E，见封四）;③肿瘤的舌状突出超出肿瘤组织的下缘进入周围脂肪（图1F，见封四）。

2.2 VPELI情况及与不良预后因子的关系

弹力纤维染色的VPELI检出率明显高于HE染色的VPI检出率（P < 0.05）。见表1。VPELI阳性患者与VPI阳性患者的淋巴结转移、VI、神经侵犯及肿瘤出芽发生率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。VPELI阳性的肿瘤患者其淋巴结转移、静脉侵犯及肿瘤出芽发生率高于VPELI阴性的肿瘤患者（P < 0.05），两者神经侵犯情况比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。脏层腹膜弹力层不存在患者的不良预后因子发生情况与VPELI阴性患者比较，差异无统计学意义（P > 0.05），但脏层腹膜弹力层不存在患者神经侵犯发生例数明显少于VPELI阳性患者（P < 0.05）。见表3。

2.3 HE染色和弹力纤维染色检测的血管侵犯情况比较

弹力纤维血管侵犯的检出率为66.7%，高于HE染色的32.0%（P < 0.05）。见表4。弹力纤维染色检出血管侵犯的特异性为100.0%（25/25），敏感性为65.8%（50/76）。

3 讨论

近年来，我国结直肠癌发病率逐年升高，严重威胁我国居民身体健康[1，7]。研究发现，pT4与pT3期肿瘤比较，患者生存率明显下降，肿瘤组织是否穿透脏层腹膜是区分两者的重要标志[8-9]。相关研究表明在浆膜破坏的情况下，弹力纤维染色可以显著提高VPELI的检出率[10-12]。AJCC肺癌分期中已使用弹力纤维层侵犯代表胸膜侵犯，肺癌组织侵犯超过弹力纤维层或侵犯胸膜表面均可定义脏层胸膜侵犯[13-16]。而结直肠癌是否能够使用VPELI代替VPI需要进一步探讨。

弹力纤维层侵犯是Ⅱ期结肠癌复发的独立危险因素[17-18]。另有研究证实VPELI阳性的pT3期肿瘤和pT4a期肿瘤预后相似，却是PT3期肿瘤的不良预后因子[10，19]。与之前结果类似，在本研究中，弹力纤维染色判读的VPELI检出率明显高于VPI检出率。同时本研究发现除神经侵犯以外，VPELI阳性肿瘤与淋巴结转移、VI及肿瘤出芽均具有相关性。目前VPELI的另一个焦点问题是对于脏层腹膜弹力层无法识别的肿瘤如何判读和分期。研究证实pT3期肿瘤中未检出脏层腹膜弹力层病例与VPELI阴性病例相比的上述不良预后因子无显著性差异，弹力纤维层缺失不影响肿瘤预后的判断，但是否对肿瘤5年生存率及总体生存率有影响还需进一步观察[10]。本研究结果显示，VPELI阳性患者与脏层腹膜弹力层不存在患者比较，其神经侵犯发生率明显增高;而VPELI阴性患者与脏层腹膜弹力层不存在患者比较，这4种不良预后因子发生率均无明显差异。因此与VPI相比VPELI的侵犯能够更加客观地提示肿瘤的预后并指导肿瘤治疗用药，而对于弹力纤维层侵犯是否等同或者能够替代VPI影响结直肠的分期，还需要通过大样本研究寻找更多的科学证据进行验证。

结直肠癌的AJCC指南指出血管受侵是独立于现有的Dukes分期/pTNM分期而影响患者预后的一项十分重要的检测指标[20]。本研究结果提示弹力纤维染色可以显著提高VI检出率，这与相关学者等[6，18]的研究发现一致。

总之，本研究结果提示弹力纤维染色可以有效地提高结直肠癌VPELI和VI的检出率，VPELI阳性肿瘤患者提示预后不良。弹力纤维染色可能为结肠癌分期及预后提供更有价值的参考，VPELI在结肠癌病理分期及预后评估方面将起到更加重要的作用。

[参考文献]

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