焦磷酸测序技术对肠促胰素作用相关基因的SNP位点分型

施爱明 钱晨月 赵奉伦 苏存锦 潘杰

(苏州大学附属第二医院，江苏 苏州 215004)

胰岛素的分泌受餐后血糖水平升高的刺激，也受肠促胰素效应的调控，在健康者中，肠促胰素效应负责大约70%的餐后胰岛素分泌，对正常机体的血糖调节过程起着重要作用。然而生理性肠促胰素在分泌后1～2 min内即被二肽基肽酶(DPP)-4降解失活，DPP-4 抑制剂通过抑制DPP-4 对活性肠促胰素的水解作用，增加活性肠促胰素的水平而改善血糖控制，是治疗2型糖尿病(T2DM)的新靶点〔1，2〕。临床使用过程中发现，DPP-4抑制剂的疗效存在个体差异，决定DPP-4抑制剂治疗反应的因素目前尚未完全阐明，个体遗传基因差异可能是影响DPP-4抑制剂疗效反应原因之一。研究发现，T2DM患者普遍存在肠促胰素效应减弱，可能原因包括肠促胰素分泌减少、DPP-4降解肠促胰素活性升高及肠促胰素受体信号转导通路受损等；因此参与肠促胰素合成、降解和作用通路的相关基因的遗传变异成为研究 DPP-4抑制剂疗效差异的靶点〔3～7〕。

本研究拟对编码胰高血糖素样肽受体(GLPIR)基因的rs3765467位点和抑胃肽受体(GIPR)基因的rs10423928位点、肠促胰素合成通路中TCF7L2基因的rs7903146位点、影响DPP-4酶活性的rs4664443和rs12617656位点，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增联合焦磷酸测序技术建立单核苷酸多态性(SNPs)的检测方法，并验证其准确性和可行性，为研究肠促胰素作用相关基因的SNP与DPP-4抑制剂疗效的相关性奠定基础。

1 对象与方法

1.1对象 选择2018年1～6月苏州大学附属第二医院就诊的口服DPP-4抑制剂的T2DM患者35例，其中男27例，女8例，平均年龄为(55.6±14.7)岁。

1.2仪器与试剂 凝胶成像系统和水平电泳槽(上海Bio-Rad公司)；PCR扩增引物和焦磷酸测序引物合成(上海生工生物有限公司)；血液基因组DNA提取试剂盒(美国Magen公司)；PCR扩增试剂盒(日本Takara公司)；美国ABI Veriti96 PCR仪(美国ABI生物系统公司)；PyroMark Q24焦磷酸测序仪和焦磷酸测序试剂盒(德国Qiagen公司)。

1.3基因组 DNA的提取采用DNA提取试剂盒进行35例T2DM患者的全血DNA提取，并进行质量检测和纯度鉴定，确保每份DNA浓度大于30 μg/μl，提取后DNA样本置于-20℃保存备用。

1.4引物设计 在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上分别下载rs3765467、rs10423928、rs7903146、rs4664443及rs12617656这5个SNP位点所在的基因序列，采用PyroMark Assay Design Software2.0(德国Qiagen公司)设计PCR引物和测序引物。5个SNP位点引物见表1。

表1 rs7903146，rs12617656，rs4664443，rs3765467和rs10423928引物序列

1.5PCR扩增 PCR总反应体积为50 μl，包括：Ex Taq HS 0.25 μl，10×Ex Taq缓冲液5 μl，dNTPmix 4 μl，上下游 PCR引物各1 μl，基因组DNA 5 μl，RNase-free water 33.75 μl。PCR条件：98℃ 15 min，98 10 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，共循环35个周期，循环结束后72℃10 min。所有PCR产物应用1%的琼脂糖凝胶电泳进行进一步的分析和鉴定。

1.6焦磷酸测序分型检测 取8连管，每管加入80 μl反应体系，包括磁珠1 μl，结合缓冲液40 μl，PCR产物15 μl，高纯水24 μl。1 400 r/min室温振荡10 min。打开真空泵，将真空预备工具在高纯水中清洗30 s，移到8连管的孔中抽吸样品，捕获带有PCR 产物的亲和素包被的磁珠。依次用70%乙醇、变性缓冲液、清洗缓冲液冲洗10 s，关闭真空开关，将真空预备工具置入预加有0.4 μmol/L 测序引物(10 μmol/L测序引物1 μl和退火缓冲液24 μl)的焦磷酸测序(PSQ)24孔板中，轻轻晃动，释放亲和素包被的磁珠。将PSQ 24孔板置于预热好的板架上，80℃加热2 min、室温平衡2 min后，置于焦磷酸测序仪内进行测序。通过PyroMark Q24 软件对结果进行分析。

1.7Sanger测序验证 将这35例临床样本提取的DNA送苏州金唯智生物有限公司采用 Sanger测序法检测，进行SNP的二轮验证，保证上述所建焦磷酸分型检测方法的准确性。

2 结 果

2.1PCR结果 凝胶电泳结果显示，5个SNP位点的PCR产物均在相应位置呈单一条带，见图1，扩增特异性好。

M：Marker,1.患者1，2.患者2图1 2例患者5个SNP位点PCR产物凝胶电泳结果

2.2焦磷酸测序与Sanger测序结果 对35例患者5个SNP位点的基因多态性进行了焦磷酸测序，检测信噪比高，非特异峰的比例均在 10%以内，多态位点基因型可清晰判断，检测成功率100%。为了验证方法的准确性，同时采用Sanger测序技术对上述患者的 5个 SNP位点进行测序，测序结果见图2～6，分型结果见表2。两种方法的基因分型结果完全一致，35例患者5个SNP位点的突变比例与已报道的文献结果相接近〔5，8-10〕。

A.焦磷酸反向测序；B.Sanger反向测序，下图同图2 rs3765467多态性典型测序

图3 rs10423928多态性典型测序

图4 rs7903146多态性典型测序

图5 rs4664443多态性典型测序

图6 rs12617656多态性典型测序

表2 35例患者SNP位点基因型焦磷酸测序结果〔n(%)〕

3 讨 论

经过引物设计筛选和对PCR的退火和循环等扩增条件优化，最终5个SNP位点可以在相同的条件下进行扩增，非特异性扩增产物少，PCR扩增特异性好。焦磷酸测序是一种基于DNA序列的酶联级联测序技术，被广泛应用于基因多态性检测、甲基化检测及微生物鉴定等领域〔11～14〕，本文所建焦磷酸测序方法检测信噪比高，非特异峰低，多态位点基因型可清晰判断，检测成功率100%。

文献报道韩国人GLPIR基因rs3765467位点突变纯合型比率仅为2.8%〔5〕，本文检测到突变纯合型比率与文献报道的中国人群突变纯合型比率(15.3%)相近〔8〕。Meta分析结果显示GIPR基因rs10423928位点携A碱基突变与患者糖代谢异常相关〔6〕，本研究与NCBI中dbSNP公共数据库报道的频率一致。TCF7L2基因rs7903146位点为近期研究热点，许多研究显示rs7903146位点与多种疾病发生存在相关性，Meta分析结果显示rs7903146位点的多态性与进展为T2DM风险相关〔15〕。本文结果未检测到纯合型突变，与李云〔9〕报道的200例福建籍汉族人群检测结果一致，说明此位点在中国人群发生突变的比例较低。DPP-4基因rs12617656位点野生型、杂合型和突变纯合型比例与文献报道一致〔5〕。DPP-4基因rs4664443位点野生型、杂合型和突变纯合型比例与邢晓敏〔10〕报道的中国人群的结果一致。