褪黑素对糖尿病大鼠心肌MDA、CAT及GSH-Px含量和AGE、RAGE表达的影响

孙权 刘士臣 徐伟明 孟德欣

(佳木斯大学 1基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2附属第一医院；3潍坊市坊子区仁康医院)

糖尿病(DM)是以高血糖为特征的慢性代谢紊乱综合征〔1～3〕。DM心肌病(DCM)由Hamby等〔4〕于1974年首次提出，是DM患者本身出现的特殊心肌病变，主要有心肌能量代谢或结构异常改变，导致心肌细胞重塑，最终引起心脏收缩和舒张功能障碍〔5〕。褪黑素(MT)由松果体分泌，对人类的睡眠、生殖及昼夜节律等起到调节作用，对机体的神经、内分泌和免疫系统均有影响。研究发现，MT是一种很强的抗氧化剂，可有效清除氧自由基〔6〕，提高机体内超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低过氧化脂质(LPO)的水平，降低血清中丙二醛(MDA)含量〔7，8〕，也可以诱导抗氧化防御酶和抑制细胞凋亡，从而发挥抗氧化效应，对多种疾病具有防治效用。本文拟分析MT对DM大鼠心肌MDA、达氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量、糖基化终末产物(AGE)及其受体(RAGE)表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂 清洁级雄性Wistar大鼠80只(长春亿斯实验动物技术有限责任公司购买)，体重180～200 g，佳木斯大学动物实验中心分笼饲养，每天光照12 h，自由摄食和饮水。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；MT(浙江延年褪黑素公司)。

1.2动物分组、模型建立、给药 大鼠适应性喂养1 w后，随机分为正常组、模型组、低剂量MT组和高剂量MT组各20只，分笼饲养。模型组、低剂量MT组和高剂量MT组给予高脂高糖饮食4 w。大鼠禁食12 h，腹腔注射1%STZ 50 mg/kg体重，正常组按照同等剂量注射柠檬酸缓冲液。给药后72 h尾静脉采血，空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。实验时每4 w检测血糖一次。造模后每天10∶00～14∶00灌胃给药一次，低剂量MT组剂量为10 mg/kg体重，高剂量MT组为20 mg/kg体重，正常组和模型组同等剂量生理盐水灌胃。持续给药16 w。

1.3血糖值测定 给药前，给药后和实验中分别检测大鼠空腹血糖。测量前禁食、水12 h，尾静脉采血，血糖仪测量血糖值。

1.4标本采集 断髓法处死实验大鼠，剪开大鼠胸骨，打开胸腔，暴露心脏。沿着心底大血管的根部剪断大鼠心脏，剖开右心耳，由左心室进针用200 ml左右生理盐水冲洗，当右心耳流出无色液体时可以停止冲洗，再用4%多聚甲醛溶液进行心脏固定，游离心脏放入10%中性甲醛溶液内浸泡。而后将组织制成5 μm厚石蜡切片。

1.5HE染色 ①脱蜡至水;②苏木素染色6 min，蒸馏水冲洗5 min;③1%盐酸-乙醇分化30 s，再次蒸馏水冲洗5 min;④伊红染色3 min，蒸馏水冲洗5 min;⑤脱水透明;⑥中性树胶封片;⑦显微镜下组织学观察并拍照。

1.6超敏二步法免疫组化染色 ①烤片30 min;②脱蜡脱水后将切片放入盛有TBS缓冲液的抗原热修复盒中，微波炉中加热至煮沸，20 min后取出，自然冷却，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，各5 min;③5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，37℃，20 min;④一抗(RAGE浓度为1∶50，AGE浓度为1∶100)，4℃过夜;⑤复温至室温，PBS洗3次，各5 min;⑥试剂Ⅰ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min。试剂Ⅱ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min;⑦二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下观察，随时中断，蒸馏水洗3次，各3 min;⑧苏木素染色片刻，1%HCl-酒精分化30 s，蒸馏水洗3次，各5 min，自来水冲洗2 h(AGE染色时，省略此步);⑨片子脱水透明;⑩中性树胶进行封片;图像采集分析采用BI200软件，IOD值越小，阳性表达越高。

1.7比色法测定MDA、CAT和GSH-Px含量 制备10%心肌组织匀浆后测定蛋白含量，用试剂盒测定。

1.8统计学处理 使用SPSS19.0软件进行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1精神状态 正常组精神状态佳，每日摄取食物量比较稳定，体重增加量随周龄的增加而增加，动作反应敏捷，皮毛光滑有光泽，眼睛发亮有神，鼠尾色泽淡红，大、小便正常。模型组精神状态萎靡，每日摄取食物量增多、过频，体重增加随周龄增加缓慢有的甚至不增加，动作反应有些迟钝，皮毛灰暗而无光泽，眼睛暗淡无神，鼠尾颜色淡白，大便时干时稀，小便过频。低剂量MT组和高剂量MT组精神状态欠佳，每日摄取食物量趋于正常，体重增加迟缓，随周龄增长略有增加，动作反应略有缓慢，皮毛比较柔顺略有光泽，眼睛发灰，略显呆滞，鼠尾毛色略有光泽，大便略稀，小便趋于正常。

2.2血糖测定 MT处理16 w后，与正常组〔(5.77±0.73)mmol/L〕比较，模型组、低剂量MT组和高剂量MT组血糖〔(22.73±3.05)、(20.94±0.74)、(21.17±2.97)mmol/L〕明显升高(P<0.05)；与模型组比较，低剂量MT组和高剂量MT组血糖值虽略降低，但无统计学意义(P>0.05)。

2.3MDA、CAT和GSH-Px含量比较 MT处理16 w后，与模型组比较，低剂量MT组和高剂量MT组MDA含量明显降低，CAT、GSH-Px含量明显增高(P<0.05)；而与正常组比较，低剂量MT组和高剂量MT组MDA、CAT、GSH-Px含量无明显差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组心肌组织中MDA、CAT和GSH-Px含量测定

2.4心肌HE染色结果 正常组心肌细胞体积正常，排列整齐，心肌各层均匀，结构清晰；胞质清澈，胞质颜色正常；心肌细胞核圆形或椭圆形，染色质分布均匀。模型组心肌细胞体积明显增大，排列紊乱、肿胀，心肌各层次不均，结构不清；胞质浑浊，颜色变浅；细胞核呈长杆状，核固缩，核膜皱缩，出现双核，排列紊乱，染色质边聚于核膜下呈颗粒状。低剂量MT组和高剂量MT组心肌细胞体积略小，排列趋于整齐，心肌各层次结构和心肌细胞间隙略清晰可以辨认；胞质略有浑浊，颜色略浅，细胞核形态趋于正常的圆形或椭圆形，染色质均匀可见。低剂量MT组较高剂量MT组更明显一些(图1)。

图1 各组心肌HE染色(×400)

2.5心肌AGE和RAGE表达含量变化 AGE棕黄色阳性表达见于心肌细胞胞质或心肌间质内。RAGE棕黄色阳性表达多见于心肌细胞膜。模型组AGE、RAGE棕黄色斑块较正常组明显增多且颜色深染，而低剂量组和高剂量MT组细胞中棕黄色斑块减少，颜色变浅。MT处理16 w后，与模型组比较，低剂量MT组和高剂量MT组AGE、RAGE蛋白表达IOD值明显增多(P<0.05)；而与正常组比较低，剂量MT组和高剂量MT组AGE、RAGE蛋白表达无明显差异(P>0.05)(表2和图2)。

表2 各组心肌组织中AGE和RAGE蛋白表达

图2 各组心肌中AGE、RAGE蛋白免疫组化(×400)

3 讨 论

生理状态下，人和哺乳动物血清中MT的含量随着昼夜交替，呈节律性的波动，其分泌量表现为，夜间比白天要高出5～10倍，正常情况下，凌晨2∶00～3∶00达到分泌量最高值。研究表明，MT对DM大鼠血糖的影响有两种观点：MT可以通过改善胰岛素抵抗程度〔9〕和调控胰岛β细胞胰岛素的分泌释放〔10，11〕，影响机体胰岛素的代谢，并能促进细胞对葡萄糖的利用，从而影响机体的血糖代谢，直接降低DM大鼠血清中的血糖水平；报道〔12〕显示MT对血糖水平没有影响，可能由于实验过程中给药时间、给药方式和给药剂量不同等所致。

氧化应激是指打破机体内氧化与抗氧化作用的动态平衡，机体趋向于被氧化状态，导致体内中性粒细胞炎性过度浸润，蛋白酶的分泌量过度增加，产生大量氧化代谢的中间产物——活性氧簇(ROS)。ROS是导致人体衰老及各种疾病发生的一个重要因素，已被普遍人们所认可。ROS在体内以游离的自由基存在，主要为超氧阴离子、H2O2和羟自由基(OH)等为主。体内ROS的大量存在通过多种途径导致细胞凋亡，造成组织损害。ROS既是促发和加速线粒体膜通透性转运孔(MPT)开放的重要效应分子，又是MPT开放的产物。这种正反馈机制使MPT开放具有自我放大效应和“全”或“无”的特点，使线粒体膜电位的下降进入不可逆过程，细胞发生凋亡，造成细胞损害。机体内除有氧化系统，也有抗氧化系统，抗氧化系统有两大类：一类是酶类抗氧化系统，包括CAT、GSH-Px、SOD等；另一类是非酶类抗氧化系统，有维生素E、GSH、维生素C等，还有一些微量元素硒、锌和铜等。这两类抗氧化系统主要是通过直接或间接地方法降低ROS在体内的含量，如CAT主要催化分解体内的H2O2，降低其在体内的含量，避免造成细胞组织的损伤。维生素C可以有效地清除自由基，通过逐级供给电子而转变为半脱氧抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的过程清除体内超氧阴离子、OH、有机自由基(R)和有机过氧基(ROO)等自由基。MDA是机体内自由基作用于脂质后发生过氧化反应，氧化代谢的终产物，可引起蛋白质、核酸等生命大分子发生交联聚合，具有细胞毒性。MDA也会影响线粒体呼吸链复合物和线粒体内关键酶的活性，并且还可以加剧质膜的损伤。在生物体内衰老与抗衰老的生理性研究中，MDA含量是一个常用的重要的氧化指标。CAT是一种酶类自由基清除剂，为生物防御体系的关键酶，存在于动物的各种细胞组织内，以肝脏中浓度最高，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，清除体内过多的过氧化氢，从而使机体细胞免于遭受H2O2的毒害。CAT作用于H2O2的机制是H2O2的岐化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇碰撞在活化中心上，H2O2浓度越高，分解越快。CAT是过氧化物酶体系的标志酶，约占过氧化物酶体系酶总量的40%，是一种生物体内研究抗氧化的重要指标。GSH-Px是一种重要的过氧化物分解酶，广泛存在机体内，GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸。GSH-Px主要包括4种，分别为组织GSH-Px、血浆GSH-Px、磷脂氢过氧化物GSH-Px及具有胃肠道专属性GSH-Px。在氧化应激反应的途径中，GSH-Px的活力大小是机体内抗氧化能力重要指标的体现。

MT是人体自体分泌的体内天然的抗氧化剂，兼有脂溶性和水溶性，能自由通过细胞膜，能直接和(或)间接清除人体内多种自由基，并能够增强抗氧化酶类的活性。MT与细胞膜上受体结合后，通过第二信使如环磷酸腺苷(cAMP)、磷脂酶C等使细胞内磷酸化级联反应激活相关蛋白，进而调节抗氧化酶的活性及相关基因的表达。大鼠切除松果体后，可使大鼠体内的氧自由基过多堆积，ROS的活性和氧化应激反应增强〔13〕。而Geeta等〔14〕给予患者外源性MT 1个月后，发现患者体内的MT水平升高、活性增强、MDA浓度下降，证实MT可以改善T2DM患者体内的氧化应激反应的状态。也有研究学者研究表明给予DCM患者外源性MT 2个月后，体内细胞组织中MDA浓度降低，血浆和胞质中GSH-Px浓度和活性都有所增加，氧化应激反应水平降低，并且空腹血糖及糖化血红蛋白水平较治疗前明显改善〔15〕。Hegab等〔16〕给予STZ诱导的DM大鼠外源性MT后，发现MT能使部分坐骨神经的传导速度得到一定的恢复，并能显著降低血清内MDA的浓度，这说明MT能改善DM患者的神经病变，对抗体内增强的氧化应激反应。本实验结果也表明，MT可通过多条件途径抑制DM心肌细胞中的过度氧化应激状态。AGE是蛋白质的氨基酸、脂质和脂蛋白非酶性糖基化反应的终末产物，在DM的微血管并发症中，RAGE信号通路扮演着重要角色〔17〕。AGE广泛存在于机体的血液及各种组织、细胞中，AGE作用广泛，通过两种途径发挥其生物学效应：①直接途径，直接修饰改变蛋白质、脂质和核酸等的空间结构和功能，造成机体损伤；②间接途径，AGE与特异性受体RAGE结合后，导致机体发生病理性改变，可激活多个细胞内信号转导通路，可诱导生成氧自由基及灭活一氧化氮(NO)等，参与不同类型细胞的氧化应激反应、炎性反应和血栓形成的过程〔18〕。高血糖状态下，蛋白质发生糖基化后，氧自由基生成也随之增加，并促进AGE形成，从而导致恶性循环〔17〕。AGE生成具有不可逆性，即使纠正了高血糖，AGE也不能降至正常水平，且可在组织中继续不断的累积。因此，AGE在DM并发症的发生和发展的全过程中起到重要作用。

RAGE广泛存在于人体各类细胞中，属于多配体受体，不仅参与内体炎症反应，还与DM慢性并发症的发生、发展有关。RAGE与AGE结合后，激活相关信号反应，使内质网膜电位去极化和减少糖原合成酶激酶(GSK)-3β磷酸化，导致细胞功能障碍。DM可以引起心房重构，扰乱心房内传导系统，是房颤的危险因素之一。AGE与RAGE的结合与DCM的发生密切相关，阻断两者的结合可能会成为预防和治疗DCM的新靶点〔19，20〕。MT可抑制AGE和RAGE间的相互影响，从而能减轻DCM患者的心肌损伤程度，延缓病程。

致谢：黑龙江省北药与功能食品优势特色学科建设项目的支持！