温阳振衰颗粒对慢性心力衰竭模型大鼠心肌LncRNA BIC/miR-155调控P38MAPK表达的影响

徐则林 陈新宇 陈青扬 吴治谚 蔡虎志

(1湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2江门五邑中医院)

慢性心力衰竭(CHF)由冠心病、高血压、心脏瓣膜病、扩心病等各类原发心脏疾病发展至后期所致，临床以体液潴留为主要体征，以胸闷乏力、呼吸困难、活动受限为主要表现〔1～3〕。课题组长年从事CHF的中医药防治工作，前期研究证实丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)四大亚型中与炎性刺激密切相关的P38MAPK亚型与CHF的发展密切相关，且P38MAPK的蛋白磷酸化程度随着CHF的进展也显著上调，温阳振衰颗粒可以抑制P38MAPK蛋白磷酸化的过度表达〔4〕。作为P38MAPK的上游非编码基因，LncRNA BIC/miR-155能通过MAPK激酶(MKK)-3及MKK-6通路直接调控P38MAPK mRNA的表达〔5,6〕。本研究拟进一步阐释温阳振衰颗粒是否通过LncRNA BIC/miR-155调控P38MAPK进而对CHF产生治疗作用。

1 材料与方法

1.1动物 40只SD健康SPF级实验大鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供〔SCXK(湘)2014-002〕，所有实验大鼠自由饮食，设置光/暗周期为12 h/12 h，背景噪音控制在(40±10)dB，饲养1 w适应环境。

1.2主要药物与试剂 P38抗体购自武汉博士德生物公司(BA1325-2)，p-P38抗体购自北京博奥森生物科技公司(bs-2210R)，SYBR Green PCR试剂盒由美国Thermo公司(K0223)提供，温阳振衰颗粒由湖南中医药大学第一附属医院(201606)提供，依那普利由山东辰欣药业股份有限公司提供(H20083605)，盐酸阿霉素(ADR)由深圳万乐药业有限公司提供(201708)。

1.3CHF模型建立 将ADR用生理盐水配置为2.0 mg/ml，按1.5 ml/kg进行大鼠腹腔注射造模，每周1次，连续6 w，每次注射前均重新测量体重，以此作为注射剂量的依据〔5〕。

1.4分组 从40只实验大鼠中随机抽取30只使用ADR进行造模，余10只为正常对照组。在第3次注射ADR后6 d对所有实验大鼠行心脏彩超检查，根据彩超结果进行分层，再使用随机区组设计将30只实验大鼠分为模型对照组、温阳振衰组及阳性对照组〔4〕。

1.5给药方法 自第3次注射ADR后7 d开始，温阳振衰组用温阳振衰颗粒按1.44 g/(kg·d)进行灌胃，2次/d，3 ml/次，连续灌胃4 w。阳性对照组使用依那普利按1.8 mg/(kg·d)进行灌胃，每天灌胃2次，每次3 ml，连续4 w。正常对照组用生理盐水进行灌胃，每天2次，每次3 ml，连续4 w〔4〕。

1.6心脏彩超检查 选择左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室收缩末内径(LVSD)、左室舒张末内径(LVDD)5个心脏彩超常用指标作为检查指标，取5个心动周期求平均值。

1.7Western印迹检测 取心肌组织总蛋白50 μg并加入2×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，在100℃环境中持续变性8 min后，使用16 mA/gel恒定电流电泳15 min，再修改为32 mA/gel恒定电流电泳至底部。按膜面积0.8 mA/cm2设定恒定电流进行电转印，加入一抗并在4℃环境中过夜后加入酶标二抗，在室温中杂交2 h。TBST漂洗3次，每次10 min，后ECL曝光显像，扫描，保存，分析。

1.8RT-PCR检测 从液氮罐中取出保存的实验大鼠心肌组织，登录NCBI基因库并从中查询LncRNA BIC、miR-155和P38MAPK的基因序列，根据相应引物序列设计引物，严格按照PCR反应试剂盒说明书进行荧光定量RT-PCR分析。LncRNA BIC-上游引物：CTATCAGTGGCTACCAACC，下游引物：AACAGTTACACAGCCTTCA ，长度101 bp；miR-155-上游引物：GGGTTAATGCTAATTGTG，下游引物：AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC，长度61 bp；P38MAPK-上游引物：TGCCTTCCTCTACTCCAT，下游引物：TAGCCAGAAAGTCCATCA，长度98 bp；内参U6-上游引物：GCTTCGGCACGTAACATATACTAAAAT，下游引物：CGCTTCACGACCTAGTGCGTGTCAT，长度89 bp。

1.9统计学方法 使用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析、LSD法、TamhaneT2法。

2 结 果

2.1实验后各组心功能LVEF、LVFS的变化 各实验组LVEF、LVFS较正常对照组显著降低(P<0.05)，药物干预两组LVEF、LVFS较模型对照组差异有统计学意义(P<0.05)，其中温阳振衰组效果改善LVEF效果最为显著，与阳性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2实验后各组心功能LVSD、LVDD比较 各实验组LVSD、LVDD较正常对照组显著增高(P<0.05)，药物干预两组LVSD、LVDD较模型对照组有所降低，差异有统计学意义(P<0.05)，温阳振衰组与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组心功能LVEF、LVFS、LVSD、LVDD及心肌P38MAPK与p-P38MAPK表达比较

2.3各组心肌p-P38MAPK与P38MAPK的表达 各实验组心肌p-P38MAPK表达较正常对照组显著升高(P<0.05)。温阳振衰组上调程度较阳性对照组更缓，差异有统计学意义(P<0.05)，各组心肌P38MAPK表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图1。

1～4:正常对照组、模型对照组、温阳振衰组、阳性对照组图1 各组心肌P38MAPK与p-P38MAPK的表达

2.4各组心肌LncRNA BIC、miR-155及P38MAPK mRNA的表达 实验后各实验组心肌LncRNA BIC和miR-155表达明显低于正常对照组(P<0.05)。温阳振衰组下调程度最为缓慢，差异有统计学意义(P<0.05)，各组心肌P38MAPK mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图2。

表2 各组心肌LncRNA BIC、miR-155及P38MAPK mRNA的表达

图2 各组心肌LncRNA BIC、miR-155及P38MAPK mRNA的表达

3 讨 论

细胞是组成生命的基本结构，细胞的结构和功能改变都是以一系列细胞内信号转导为基础。MAPK是机体应激反应、炎性刺激、血管生成、凋亡诱导的信号通路反应中枢，P38MAPK是MAPK家族中的四大亚族之一，是介导细胞炎性反应的主要信号通路蛋白。P38MAPK被上游调控基因或环境相关因素刺激激活后，可以通过磷酸化修饰进而激活多种转录因子，形成心肌细胞的级联式炎性瀑布反应，导致心肌细胞损伤〔7，8〕。miR-155属于短链非编码RNA，虽然不具备传统中心法则编码蛋白质的功能，但可通过影响MKK-3及MKK-6从而对P38MAPK的表达进行调控，从而影响P38MAPK的蛋白磷酸化表达量。在心血管系统疾病领域，miR-155有广泛的调控作用，有报道显示过表达miR-155可以显著增加心肌干细胞移植成功率，且上调miR-155可以对炎性因子白细胞介素(IL)-6及肿瘤坏死因子(TNF)-α有明显的抑制作用〔9～13〕。作为miR-155的直接编码基因LncRNA BIC，人类LncRNA BIC于2001年被发现，而大鼠的LncRNA BIC直到2015年11月15日才正式上传至NCBI基因数据库，因此，LncRNA BIC调控miR-155进而影响P38MAPK这条信号通路极具研究价值。

温阳振衰颗粒由湖南省名中医陈新宇教授创制，该中药复方由附子、干姜、甘草、红参等六位中药组成。方中君药附子具有温补肾阳，扶阳破阴，一扫阴霾之功；红参具有回阳救逆，复脉固脱，振奋心阳之效〔14〕。炙甘草调和诸药，亦兼补土功效，需知“火得土覆方可久存”〔15〕。前期课题组证实了P38MAPK的蛋白磷酸化程度与CHF的发展呈显著正相关性，温阳振衰颗粒可以抑制P38MAPK蛋白磷酸化的过度表达〔4〕。本研究结果说明，LncRNA BIC和miR-155的高表达对心肌细胞有保护作用，且LncRNA BIC/miR-155可能通过调控P38MAPK的蛋白磷酸化从而介导炎性反应，温阳振衰颗粒有可能通过上调心肌细胞中LncRNA BIC/miR-155的表达进而抑制P38MAPK蛋白过度磷酸化后介导的炎性因子对心肌细胞的损伤作用，这可能是温阳振衰颗粒治疗CHF的重要分子机制之一。