胆固醇转运抑制剂U18666A对星形胶质细胞β-分泌酶含量及活性的影响

杨宏艳 都晓辉 包亚男 韩云峰

(齐齐哈尔医学院 1药学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2公共卫生学院)

阿尔茨海默病(AD)是一种以进行性认知功能障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征为细胞外β淀粉样斑块沉积、细胞内神经纤维缠结和大量神经元的丢失。胆固醇对于神经元的发展及突触弹性和功能的维持起重要作用。流行病学资料显示，体内胆固醇水平升高与AD发病相关，降低细胞内胆固醇水平或改变体内胆固醇的分布能降低AD的发生〔1～4〕。U18666A(UA)为胆固醇转运抑制剂，被广泛用来研究胆固醇和淀粉样前体蛋白(APP)代谢的关系〔5,6〕。本研究以原代培养的星形胶质细胞为研究对象，观察UA对星形胶质细胞APP、β-分泌酶(BACE)的含量与活性及β淀粉样蛋白(Aβ)生成的影响，探讨UA对APP代谢的调节，为AD的发病机制研究及治疗提供新的视角。

1 材料和方法

1.1试剂 UA购自美国Enzo Life Sciences公司；BACE活性荧光检测试剂盒购自Abcam公司；Fillipin购自Sigma公司；Aβ1～42酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自Life Technologies公司；APP 抗体和BACE1抗体购自Abcam 公司；β-actin 抗体、辣根标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中山金桥生物有限公司。

1.2仪器 CO2培养箱(美国 Thermo 公司)，酶标仪 Thermo 3001(美国 Thermo 公司)，倒置荧光显微镜(德国 ZEISS 公司)，电泳仪和全功能荧光化学发光成像仪(美国 Bio-Rad 公司)。

1.3细胞培养 大鼠原代星形胶质细胞购自ScienCell 公司。细胞培养在含有2%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液和1%星形胶质细胞生长辅助因子(AGA)的AM-a培养基中，置于 5% CO2的37 ℃ 培养箱中培养。每2～3 d换液 1 次。

1.4Fillipin染色测定星形胶质细胞内胆固醇分布 星形胶质细胞按照2×105/ml密度接种于铺有小玻片的24孔板中(小玻片需提前用多聚赖氨酸包被)，置于37℃培养箱中培养。待细胞生长至80% 融合时，加入5 μg/ml的UA作用24 h，弃去培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，加入4% 多聚甲醛室温固定20 min，PBS漂洗后加入125 μg/ml Fillipin，避光孵育1 h。PBS洗3次后，取出玻片扣在滴有封片剂的载玻片上，荧光显微镜拍照观察胆固醇的分布。

1.5Western印迹测定APP及BACE1蛋白表达 星形胶质细胞培养在75 cm2培养瓶中，加入1、3、5 μg/ml UA作用24 h，收集细胞，加入RIPA 裂解液冰上裂解 30 min，按照本组实验方法提取蛋白〔7〕。配制10%分离胶和5%浓缩胶，加入等量蛋白样品(15 μg/L)电泳，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h后，一抗孵育：anti-APP(1∶5 000)，anti-BACE1(1∶2 000)，4℃过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000) 室温孵育1 h后，TBST洗3次，化学发光液显影成像。用 Quantity-One 软件分析结果。

1.6荧光法检测BACE活性 星形胶质细胞培养在75 cm2培养瓶中，加入5 μg/ml UA作用24 h，PBS冲洗细胞，加入100 μl提取缓冲液，冰上裂解30 min，4℃，12 000 r/min，离心5 min，收集上清，采用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量，调整蛋白浓度为25 μg/ml。按照试剂盒说明，设置空白孔、阳性对照孔、阴性对照孔和样品孔。每孔加入50 μl反应缓冲液，阳性对照孔加入2 μl活性BACE，阴性对照孔加入2 μl BACE抑制剂，37℃ 预孵育10 min后，除空白孔外，其余各孔加入2 μl底物，混匀，37℃避光孵育1 h，在激发波长335 nm，发射波长495 nm检测16 h内连续的荧光强度变化，计算BACE活性。每组设2个复孔，实验重复4次。

1.7ELISA检测星形胶质细胞Aβ1～42含量 UA(1、3、5 μg/ml)作用星形胶质细胞24 h后，收集细胞，提取蛋白。按照试剂盒说明书设立空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl，37℃反应120 min，甩干液体，每孔加生物素抗体工作液100 μl，37℃孵育60 min，洗板，加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μl， 温育60 min后，洗板，每孔加入底物溶液90 μl，37℃避光显色30 min，加入终止液50 μl，450 nm酶标仪测量各孔的光密度值，计算细胞内Aβ1～42含量。每组2个复孔，实验重复3次。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件进行单因素方差分析、LSD检验、重复测量方差分析。

2 结 果

2.1UA对星形胶质细胞胆固醇分布的影响 Fillipin染色结果显示，在未加入UA的对照组中呈现微弱的荧光；5 μg/ml UA作用星形胶质细胞24 h后，蓝色荧光明显增强，并呈点状聚集。提示UA引起星形胶质细胞胆固醇明显蓄积。见图1。

图1 UA对星形胶质细胞胆固醇分布的影响

2.2UA对星形胶质细胞APP及BACE1蛋白表达的影响 与对照组(100.00±1.27)相比，3、5 μg/ml UA作用于星形胶质细胞24 h，APP蛋白表达(125.40±8.27、153.60±10.09)明显增加(P<0.05，P<0.01)，呈剂量依赖性；BACE1蛋白表达没有明显改变。见图2。

1～4：对照组、1、3、5 μg/ml UA组图2 UA对星形胶质细胞APP蛋白及BACE1蛋白表达的影响

2.3UA对星形胶质细胞BACE活性的影响 与对照组相比，5 μg/ml UA作用于星形胶质细胞24 h后，BACE的活性明显增强(P<0.05)。见图3。

2.4UA对星形胶质细胞Aβ1～42含量的影响 ELISA实验结果显示，3、5 μg/ml UA作用星形胶质细胞24 h后，与对照组(100.00±8.35)相比，Aβ1～42含量(135.71±5.18、156.09±17.62)明显增加(P<0.05，P<0.01)。

与对照组比较：1)P<0.05图3 UA对星形胶质细胞BACE活性的影响

3 讨 论

研究显示，高胆固醇饮食可以使AD动物模型脑内的Aβ聚集增多，长期服用大剂量他汀类药物可改善临床上轻中度AD患者的认知功能障碍〔8～10〕。目前研究胆固醇代谢与AD的关系已成为AD发病机制研究中的一个热点。UA是胆固醇转运抑制剂，尤其抑制胆固醇从溶酶体向细胞膜的转运，从而使合成的胆固醇聚积在溶酶体中，引起胆固醇在核内体-溶酶体(EL)系统的再分布。胆固醇染色技术常用于细胞或组织中胆固醇的定位与定量观察，目前常用的染色方法主要有Fillipin法、胆固醇氧化酶-DAB法及BC-θ毒素法。其中Fillipin是一种能结合胆固醇的荧光多烯抗生素，故能用来定位胆固醇在细胞内的位置。Fillipin染色法特异性强，操作简单，图像清晰，易于分辨和观察。星形胶质细胞是胶质细胞的一种特殊形式，它可以帮助维持血脑屏障，向神经组织运输营养，在大脑和脊髓修复中扮演重要角色。AD患者及转基因动物脑中可见大量激活的星型胶质细胞，提示星形胶质细胞与AD的发生发展有密切关系〔11,12〕。本研究结果显示，加入UA 后，星形胶质细胞内胆固醇呈现点状蓄积。胆固醇局部浓度升高有利于BACE和γ-分泌酶发挥作用〔13,14〕。因此，调节胆固醇的分布能够影响APP代谢，进而影响AD进程。

Aβ的生成过多和细胞外沉积是AD发病的主要病因。Aβ主要由APP经水解产生。APP 有两条代谢途径：一是经α-分泌酶水解，生成可溶性多肽sAPPα，由于切割位点在Aβ 序列内，不产生完整的Aβ 片段；另一条途径是经BACE水解生成sAPPβ和C端跨膜片段β-CTF，β-CTF继续被γ-分泌酶切割，释放出Aβ1～40或Aβ1～42，此为APP代谢的经典途径〔15〕。BACE的含量和活性大小直接决定了Aβ的生成。本研究结果显示，UA明显增强星形胶质细胞APP的表达。5 μg/ml UA 作用星形胶质细胞24 h 后对BACE1蛋白表达没有影响，却能明显上调BACE的活性，增加Aβ1～42含量，提示UA可通过增加BACE的活性增强APP代谢。

综上，UA引起星形胶质细胞胆固醇的聚积，促进了APP的表达，上调BACE活性，进而增强APP的代谢，促进Aβ的生成。