miR-142-3p对子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

2020-08-26孙沙沙李玉华

实用医药杂志 2020年8期

孙沙沙，李玉华

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，严重影响患者的身心健康，甚至危及生命［1，2］。目前，子宫内膜癌的治疗虽然取得了较大进展，但其预后较差且5年生存率＜40%［3］。因此，寻找有效的治疗靶点对子宫内膜癌的治疗具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一种内源性单链非编码小分子RNA，可调控肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学功能［4-6］，与癌症进展密切相关。研究发现 miR-142-3p在乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌等多种癌症中表达降低，可参与抑制癌细胞增殖、侵袭及迁移等过程［7-10］。有研究发现miR-142-3p在子宫内膜癌组织中的表达显著降低［11］，提示miR-142-3p可能是诊断治疗子宫内膜癌的一个重要靶点。笔者通过上调子宫内膜癌细胞miR-142-3p的表达，探究miR-142-3p对子宫内膜癌细胞增殖，迁移及侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1材料及主要试剂人子宫内膜癌细胞系（Ishikawa和HEC-1A）和正常子宫内膜细胞系（HEC-251）（中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所）。Lipofectamine 3000和Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），MTT试剂盒（北京 solaibio公司），Tranwell小室（美国 Corning公司），逆转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链反应技术检测试剂盒（日本TaKaRa公司），MMP-2和MMP-9一抗（美国Cell Signal公司），miR-142-3p mimics及相关引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2方法

1.2.1 细胞培养用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的 RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2的培养箱中培养Ishikawa，HEC-1A和HEC-251细胞。取对数期生长的细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染分别将miR-142-3p mimics及其阴性对照（miR-NC）利用 Lipofectamine 3000试剂盒法瞬时共转染HEC-1A，分为3组：空白对照组（Control）、阴性对照组（miR-NC）、miR-142-3p过表达组（miR-142-3p mimics）。

1.2.3 MTT法将转染后的HEC-1A细胞制成单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种4×103个细胞。于 37℃，5%CO2培养箱培养 0h、24h、48h、72h、96 h 后，每孔加 20 μL MTT 液（5 mg/ml）呈色。继续培养箱孵育4 h，弃去培养液。随后，每孔加入DMSO（150 μl），避光孵育 10 min。酶标仪测定各组HEC-1A细胞在490 nm处的OD值。

1.2.4 Transwell实验将转染的HEC-1A细胞置于以Matrigel基底胶包被或不包被的Transwell小室上室、下室中加入500 μl含10%胎牛血清的培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h后，用棉签擦去上室面上的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色15 min，随机取6个视野显微镜下拍照，计数迁移和侵袭细胞数。

1.2.5 荧光定量PCR检测采用Trizol试剂抽提总RNA。经微量核酸定量仪测定RNA浓度和纯度后，将RNA反转录合成cDNA。用ABI7500定量PCR仪进行荧光定量PCR实验，反应条件为95℃预变性 10 min，95℃变性10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 34 s，40 个循环。以 U6 为内参，采用 2-ΔΔCt法计算细胞中miR-142-3p的相对表达量。引物设计如下：miR-142-3p F：5’-GGGTGTAGTGTTTCCTACT-3’，R：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6 F：5’-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGCAGC-3’，R：5’-CAG TGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.2.6 Western blot检测蛋白样品按照 50 μg/孔上样，经10%SDS-PAGE电泳分离后、电转移到PVDF膜上，经5%脱脂奶粉PBST溶液封闭后，加入一抗（MMP-2，1∶1000；MMP-9，1∶1000；β-actin，1∶1000）4℃孵育过夜。加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，ECL显色。

1.3统计学分析实验数据的结果以（±s）表示，使用GraphPad Prism 8.0进行数据统计学分析。两组之间的比较采用t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-142-3p在子宫内膜癌细胞中低表达qRT-PCR结果表明，与HEC-251细胞比较，miR-142-3p在Ishikawa细胞尤其是HEC-1A细胞中的表达明显下调（P＜0.05）（图 1）。因此，选 HEC-1A 细胞进行后续实验。

图 1qRT-PCR 检测 miR-142-3p在HEC-251、Ishikawa和HEC-1A细胞中的表达与HEC-251比较（＊P＜0.05）

2.2 miR-142-3p mimics增加HEC-1A细胞中miR-142-3p的表达qRT-PCR检测发现，miR-142-3p转染后HEC-1A细胞中miR-142-3p的表达水平明显高于Control组和miR-NC组（P＜0.05）（图2）。证明miR-142-3p被成功转入HEC-1A细胞中。

图2qRT-PCR检测miR-142-3p在各组HEC-1A细胞中的表达与Control组和miR-NC组比较（＊P＜0.05）

2.3 miR-142-3p过表达抑制HEC-1A细胞增殖MTT实验表明，与Control组和miR-NC组比较，转染 24 h、48 h、72 h 及 96 h 后，miR-142-3p 组HEC-1A细胞的吸光度值显著降低（P＜0.05）（图3），表明miR-142-3p过表达能够抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖。

图3见封三。

图3 MTT检测miR-142-3p对HEC-1A细胞增殖的影响与Control组和miR-NC组比较（＊P＜0.05）

图6 Western blot检测miR-142-3p对HEC-1A细胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平的影响与Control组和miR-NC组比较（＊P＜0.05）

2.4 miR-142-3p过表达抑制HEC-1A细胞的迁移和侵袭Transwell实验结果表明，与Control组和miR-NC组比较，miR-142-3p组HEC-1A细胞的迁移率和侵袭率均显著降低（P＜0.05）（图4和5），表明miR-142-3p过表达能够抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的迁移和侵袭。

2.5 miR-142-3p过表达抑制HEC-1A细胞中MMP-2和MMP-9的表达Western blot实验结果表明，miR-142-3p转染后 HEC-1A细胞中MMP-2和MMP-9的表达水平明显低于Control组和 miR-NC 组（P＜0.05）（图 6），进一步证实 miR-142-3p过表达能够抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的迁移和侵袭能力。

图6见封三。

3 讨论

研究表明，miR-142-3p能够通过调控细胞生物学功能在癌症中发挥重要作用。朱翔宇等［12］发现miR-142-3p在结直肠癌组织及癌细胞中表达水平明显低于正常组织和细胞，且发现miR-142-3p高表达能够抑制结直肠癌细胞增殖。国外学者Behzad Mansoori等［13］证实 miR-142-3p 作为一种抑癌miRNA通过靶向Bach-1抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力。此外，高建连等［14］研究发现miR-142-3p在卵巢癌组织及癌细胞中低表达。该研究同时也表明miR-142-3p能够通过靶向调控sirtuin 1抑制卵巢癌细胞增殖。有研究发现miR-142-3p在子宫内膜癌中低表达［11］，但其对子宫内膜癌生物学行为的影响尚无报道。

该研究发现与正常子宫内膜细胞相比，miR-142-3p在子宫内膜癌细胞中低表达，与Muralidharan Jayaraman 等［11］研究一致，揭示 miR-142-3p可能是诊断治疗子宫内膜癌的一个重要靶点。MTT和Transwell实验结果表明miR-142-3p过表达显著抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖，迁移和侵袭。恶性肿瘤的重要特征是生长不受限制，这不仅是由肿瘤细胞增殖和分化失控导致的，也与肿瘤细胞的侵袭性密切相关。研究发现活化的MMP-2和MMP-9可以参与细胞外基质元素的降解，减少细胞黏附，进而促进肿瘤细胞远处迁移［15］。发现miR-142-3p过表达能够显著抑制MMP-2和MMP-9的表达水平，进一步证实miR-142-3p能够抑制子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭。