微小RNA-21对胰腺癌PANC1细胞侵袭、迁移和凋亡的影响及其作用机制

金赛燕 章惠萍 任宁宁

杭州市肿瘤医院检验科，杭州 310002

微小RNA(microRNA, miRNA)是一种广泛存在于真核生物细胞中非编码的长19～24 nt的单链小分子RNA。目前研究表明，多种miRNA参于肿瘤的发生、发展及转移，可作为肿瘤治疗的有效靶点。miRNA-21(miR-21)是一类原癌基因，在多种肿瘤组织中均有表达，其表达升高与胰腺癌患者的不良预后以及化疗抵抗密切相关[1-2]。程序性细胞死亡因子4(programmed cell death factor 4，PDCD4)属于一种肿瘤抑制基因，是重要的抗肿瘤治疗靶点。报道显示，PDCD4参与细胞凋亡，调节多种信号转导通路，可作为肿瘤抑制剂治疗恶性肿瘤[3]。Benjamind等[4]研究结果显示，向卵母细胞注射miR-21模拟物可降低PDCD4表达，但miR-21对胰腺癌细胞PDCD4表达的影响少有报道。本研究旨在观察miR-21对胰腺癌PANC1细胞侵袭、迁移及凋亡的影响，探讨其分子机制，为胰腺癌临床靶向治疗提供理论依据。

材料与方法

一、实验材料

人胰腺癌PANC1细胞系购自杭州仟诺生物科技有限公司。MTT、Transwell试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。抗磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、survivin、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9一抗和二抗均购自美国Proteintech公司，抗PDCD4一抗购自美国Invitrogen公司。

二、方法

1．重组质粒构建及细胞分组：miR-21序列由上海生工生物工程技术服务有限公司根据质粒特点进行引物设计，引入SacⅠ酶切位点。miR-21引物序列：正向引物5′-AGCTCAAAAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3′，反向引物5′-CACCTAGCTTATCAGACTGATGTTGATTTTTTG-3′。正反链混合后加退火缓冲液置95℃反应4 min，冷却至室温，形成双链。同时制备靶向miR-21的小干扰RNA(siRNA-miR-21)。采用Eco31Ⅰ酶切将双链miR-21及siRNA-miR-21分别插入质粒pGenesil-1，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，平皿接种培养24 h后挑选单克隆菌落，接种于含30 μg/ml Kana的LB培养液，置37℃振荡培养过夜。取少量大肠杆菌悬液抽提重组质粒，使用SacⅠ酶切法鉴定重组质粒是否成功。重组质粒鉴定由大连宝生物工程有限公司完成。

人胰腺癌PANC1细胞常规培养、传代。取对数生长期细胞，待培养至70%融合状态时用无血清DMEM培养过夜。采用脂质体2000将插入miR-21及siRNA-miR-21的重组质粒分别转染PANC1细胞，建立miR-21过表达细胞株(过表达组)和miR-21沉默细胞株(沉默组)，以转染空质粒组为空白组，按LipofectamineTM2000说明书操作。采用qRT-PCR法鉴定各组细胞miR-21的表达量。

2．细胞增殖检测：采用MTT法检测细胞增殖。取各组对数生长期PANC1细胞接种于96孔板，每孔2 000个细胞，分别培养24、48、72 h，每组每时间点设6个复孔，培养到时间点时向孔中加入20 μl 5 mg/ml的MTT，继续培养4 h，吸去培养液，加入100 μl DMSO，振荡5 min，上酶联检测仪测各孔波长490 nm处的值(A490值)。根据公式计算细胞增殖率。不同时间点增殖率=(不同时间点的A490值-0 h的A490值)/0 h的A490值×100%。实验重复6次，取均值。

3．细胞凋亡检测：采用流式细胞仪检测细胞凋亡。取各组对数生长期PANC1细胞，用不含四乙酸二氨基乙烷的0.25%胰酶消化5 min，用PBS洗涤、离心、重悬2次，用300目细胞过滤网过滤细胞，采用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行标记染色，避光孵育15 min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复6次，取均值。

4．细胞侵袭能力检测：采用Transwell试剂盒检测细胞侵袭能力。于Transwell小室的聚碳酸酯膜表面加入50 μl基底膜基质，待其凝固。取各组对数生长期PANC1细胞，用胰酶消化、PBS清洗1～2次后以10 g/L的BSA重悬细胞，调整细胞密度至1×105个/ml。取150 μl细胞悬液加入到Transwell上室，下室加细胞培养液，培养24 h后取出小室的隔膜，轻轻擦去隔膜上表面未穿膜细胞，用乙醇固定隔膜5 min，行台盼蓝染色，置倒置显微镜下随机选取5个200倍视野计数穿膜细胞数。每组做6个Transwell小室，取均值。

5．细胞迁移能力检测：采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。将各组对数生长期细胞接种到6孔板，培养到细胞融合达到90%时，使用100 μl的枪头垂直于孔板底部划出3条直线，间隔0.5 cm，用PBS缓冲液清洗2～3次，加含0.5%血清培养液培养24 h，置倒置显微镜下对划痕前后的相应区域拍照。每组设3个复孔，重复3次。使用Image J软件计算各组细胞迁移24 h后覆盖的划痕面积。

6．细胞PDCD4、PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表达量检测：取各组对数生长期PANC1细胞，胰酶消化、洗涤，制备成细胞悬液，采用酶联免疫法检测细胞PDCD4表达量，按试剂盒说明书操作。辣根过氧化物酶标记的抗PDCD 4抗体工作浓度1∶1 000，最后加底物邻苯二胺显色，遮光保存20 min，加入2 mol/L H2SO40.05 ml终止反应，上酶标仪上读取各孔A450值，每个样本设3个复孔，实验重复2次，取均值。

取各组对数生长期PANC1细胞，加入蛋白裂解液提取蛋白，采取BCA法定量蛋白后取50 μg样品常规行蛋白质印迹法检测细胞PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表达量，以GAPDH为内参。抗PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9一抗工作浓度1∶1 000，二抗工作浓度1∶5 000，最后用ECL发光，X片曝光、显影、定影。使用软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带与内参条带的灰度值比表示目的蛋白相对表达量。

三、统计学处理

结 果

一、各组细胞miR-21表达量比较

空白组、过表达组和沉默组miR-21表达量分别为0.54±0.11、0.96±0.24和0.15±0.06，沉默组miR-21表达量低于空白组，过表达组miR-21表达量显著高于空白组，差异有统计学意义(F=40.297，P=0.000)，表明miR-21过表达组和miR-21沉默组细胞系构建成功。

二、miR-21对胰腺癌细胞增殖的影响

除沉默组72 h时间点外，空白组、过表达组、沉默组细胞增殖率均随着培养时间的延长逐渐增加；同一培养时间点，过表达组细胞增殖率显著高于空白组，沉默组显著低于空白组，差异均有统计学意义(表1)，表明miR-21增强癌细胞的增殖能力。

表1 3组PANC1细胞培养不同时间点增殖率比较

三、miR-21对胰腺癌细胞凋亡的影响

空白组、过表达组、沉默组细胞凋亡率均随着培养时间的延长逐渐增高；同一培养时间点，过表达组细胞凋亡率显著低于空白组，沉默组细胞凋亡率显著高于空白组，差异均有统计学意义(图1，表2)，表明miR-21抑制癌细胞的凋亡。

图1 空白组(1A)、过表达组(1B)、沉默组(1C)培养24 h的PANC1凋亡细胞

表2 3组PANC1细胞培养不同时间点凋亡率比较

四、miR-21转染对胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响

空白组、过表达组、沉默组的穿膜细胞量分别为(212.4±32.5)、(508.8±50.7)、(50.9±10.6)个/200倍视野(图2)；细胞迁移覆盖面积分别为(75.6±12.1)、(118.8±20.2)、(48.8±9.5)mm2/200倍视野(图3)。过表达组均显著高于空白组，沉默组均显著低于空白组，差异均有统计学意义(F值分别为259.640、327.970，P值均<0.05)，表明miR-21增强癌细胞的侵袭和迁移能力。

图2 空白组(2A)、过表达组(2B)、沉默组(2C)的穿膜细胞数(台盼蓝染色， ×200)

图3 空白组(3A)、过表达组(3B)、沉默组(3C)的细胞24 h迁移距离(×200)

五、miR-21对PDCD4、PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

沉默组PDCD4、PTEN表达量显著高于空白组，而VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9表达量显著低于空白组；过表达组PDCD4、PTEN表达量显著低于空白组，而VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9表达量显著高于空白组，差异均有统计学意义(表3，图4)，表明miR-21的表达与PDCD4、PTEN呈负相关，而与VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9表达呈正相关。

图4 空白组(1)、过表达组(2)、沉默组(3)PANC1细胞相关蛋白的表达(蛋白质免疫印迹法)

表3 3组PANC1细胞相关分子蛋白表达比较

讨 论

miRNA能够调控某一特定的基因或者蛋白，对细胞的增殖、凋亡以及分化产生影响，起到原癌基因、抑癌基因的效果，miRNA调控异常会促进肿瘤的发生及转移[5-6]。miR-21主要定位于跨膜蛋白基因编码区域中，转录后对相关基因具有负调控作用。Wang等[7]报道，胰腺癌细胞促进肿瘤相关成纤维细胞miR-21表达，miR-21的过表达会加速癌细胞的侵袭，而沉默miR-21表达可抑制癌细胞的侵袭。Alemar等[8]指出，将抗miR-21的慢病毒质粒注入胰腺癌细胞株中，能抑制胰腺癌细胞的增殖能力，且呈时间依赖性，其中下调miR-21能有效地抑制胰腺癌细胞增殖。本研究结果显示，沉默miR-21能抑制PANC1细胞增殖，与上述研究结果一致；同时沉默miR-21能促进胰腺癌PANC1细胞凋亡，抑制癌细胞的侵袭及迁移能力。

PDCD4通过抑癌基因途径参与细胞凋亡过程，其抑癌机制为：(1)PDCD4是miR-21下游的一种靶基因，受miR-21负向调控。文献报道，miR-21-5p可在转录和翻译水平抑制PDCD4的表达，从而促进胃癌细胞的增殖能力，诱导胃癌细胞对顺铂耐药[9-10]。王子安等[11]报道，转染miR-21-5p抑制剂至胃癌耐药细胞，PDCD4基因的表达上调，对顺铂的敏感性显著升高，表明miR-21-5p能促进肿瘤细胞的耐药。(2)miR-21通过与PDCD4 mRNA的3′非翻译区结合，降解mRNA或抑制mRNA翻译蛋白，参与转录后调节[12]。本文研究结果显示，沉默组PDCD4表达上调，进一步佐证了miR-21对PDCD4存在靶向负调控作用，与Abdulhussain等[13]研究一致。

VEGF能促进血管内皮细胞增殖和毛细血管形成，提高微血管通透性，促进肿瘤发生和生长[14]。PTEN蛋白可抑制细胞增殖、转移及侵袭，诱导细胞凋亡[15]。本研究结果显示，沉默组PTEN表达上调，VEGF、survivin表达下调，提示沉默miR-21能抑制survivin、VEGF表达，促进PTEN蛋白表达上调，miR-21可能通过抑制survivin对VEGF的正向调控，增强PTEN对VEGF的负向调节，进而抑制肿瘤血管产生，诱导肿瘤细胞凋亡[16]。MMPs在肿瘤恶变过程扮演重要角色，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中研究较为热门的两种蛋白。张小博等[17]研究认为，MMP-2酶原激活后又可激活MMP-9，促进正反馈回路形成，参与恶性肿瘤扩散。Luo等[18]、张淑红[19]研究指出，PDCD4通过抑制转移相关基因VEGF、MMP-9的表达从而抑制肝癌细胞活力和迁徙及侵袭能力，促进肝癌细胞凋亡。本研究结果也显示，沉默组PDCD4表达增高，而MMP-2、MMP-9表达相应降低，提示沉默miR-21可通过增加PDCD4表达，抑制MMP-2、MMP-9表达而抑制胰腺癌细胞侵袭和迁移。

综上所述，沉默miR-21能上调PDCD4表达，进而调控PTEN、VEGF、survivin、MMP-9、MMP-2表达，抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进癌细胞凋亡。PDCD4作为miR-21的调控因子，为胰腺癌靶向治疗提供新的研究方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突