鸡血藤韧皮部环数与多指标成分的相关性分析

梅余琪,魏丽芳,邹立思,刘训红,陈佳丽,谈梦霞,王程成,蔡芷辰,殷圣鑫,张芙蓉

(南京中医药大学 药学院,江苏 南京 210023)

鸡血藤(Spatholobi Caulis)为豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤茎,收载于2015年版《中国药典》,具有活血补血、调经止痛、舒筋活络之功效,主要用于月经不调、痛经、经闭、风湿痹痛、麻木瘫痪和血虚萎黄等症[1]。鸡血藤是一味较为常用的传统中药,药用价值高,市场需求量大,为多种中成药的原料药。现代研究表明,鸡血藤主要含有黄酮类、萜类、甾醇类、蒽醌类、有机酸类等化学成分[2-4]。其中黄酮类成分具有抗肿瘤[5-7]、抗病毒[8]、抗氧化[9]、抗贫血[10]等多种药理活性；酚酸类成分原儿茶酸具有抗菌、抗炎作用,对心血管系统有明显的药理活性[11]。“辨状论质”是根据药材外观性状特征判断其质量的优劣,是中药材经验鉴别的精髓,其实质是中药材的性状特征与内在质量具有相关性。鸡血藤药材断面含深棕色树脂状物的韧皮部与木质部相间排列,呈数个偏心性半圆形环或同心性椭圆形环[12],传统经验对鸡血藤药材的质量评价认为韧皮部环数需3～8环,但这种“辨状论质”的科学内涵至今仍不清楚,尚需深入探讨鸡血藤的韧皮部环数与内在质量的相关性。

关于鸡血藤药材的质量评价研究,目前多以单一成分或单黄酮类成分为考察指标,如儿茶素、表儿茶素等黄烷醇类成分[13-15],而关于同时测定多指标成分的研究很少，且多采用高效液相色谱法(HPLC)[16-17]。超快速液相色谱-三重四极杆/线性离子阱串联质谱(UFLC-QTRAP-MS/MS)具有多反应监测(MRM)定量分析功能,融合了高灵敏度、高精度和高通量的优点,更适合中药多组分复杂体系的分离与分析[18-20]。

中药的药效是多成分多靶点协同作用的结果,因此本实验通过UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定鸡血藤中黄烷醇、异黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、紫檀烷、花色素及酚酸类共22种指标成分,对不同韧皮部环数鸡血藤共3个产区88个批次药材进行分析,探究鸡血藤韧皮部环数与指标成分含量的相关性,并结合主成分分析(PCA)对所有批次不同韧皮部环数鸡血藤药材进行综合评价。旨在为建立鸡血藤药材多指标成分的综合评价体系奠定基础,为根据性状特征评价鸡血藤的药材质量提供科学依据,亦为阐明中药传统经验精髓“辨状论质”的科学内涵提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SIL-20A XR超快速液相色谱仪、LC-20AD二元输液泵、STL-20A XR自动进样器和CTO-20AC柱温箱(日本岛津公司)；AB QTRAP 5500三重四极杆线性离子阱质谱仪、电喷雾离子源及Analyst 1.6.3软件(美国AB SCIEX 公司)；Q-500B高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司)；ME36S型电子分析天平(百万分之一,德国赛多利斯公司)；BSA224S型电子分析天平(万分之一,德国赛多利斯公司)；KQ-500B超声波清洗机(超声功率500 W,40 kHz,昆山超声仪器有限公司)；湘仪H1650-W高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；Milli-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司)。

对照品(纯度均大于98%)：樱黄素(批号lw18020202)、大豆苷(批号lw18081701)、美迪紫檀素(批号lw181025091)、染料木素(批号lw18051601)、原花青素B2(批号lw18042608)、柚皮素(批号lw18032311)、二氢槲皮素(花旗松素，批号lw18030202)、鸡蛋黄素(鹰嘴豆芽素A，批号lw18010502)、染料木苷(批号lw18082201)、甘草素(批号lw18032403)、毛蕊异黄酮(批号lw18022412),购自南京良纬生物科技有限公司；表儿茶素(批号110878-200102)、芦丁(批号100080-200707)、山柰酚(批号110861-201310)、芒柄花素(批号111703-200602),购自中国药品生物制品检定所；芒柄花苷(批号CHB1-71026)、没食子儿茶素(批号CHB151105)、表没食子儿茶素(批号CHB160513)、异甘草素(批号CHB171011),购自成都克洛玛生物科技有限公司；大豆苷元(批号C06N6Y5504)、原儿茶酸(批号B21614),购自上海源叶生物科技有限公司；儿茶素(批号20161221),购自宝鸡市辰光生物科技有限公司。甲醇、乙腈与甲酸(色谱纯,德国默克公司)；甲醇(色谱纯,江苏汉邦科技有限公司)；三氯甲烷(色谱纯,上海凌峰化学试剂有限公司)；实验用水为Milli-Q超纯水。

鸡血藤药材样品于2018年11月分别采自广东高要、越南奠边府、老挝琅勃拉邦同一植株上不同韧皮部环数(3～10环)的藤茎,趁鲜切片并晒干,经南京中医药大学刘训红教授鉴定均为豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的藤茎,表1为鸡血藤样品信息。凭证药材于南京中医药大学药学院中药鉴定实验室留样。

表1 88批鸡血藤的样品信息Table 1 Sample informations of 88 batches of Spatholobi Caulis

1.2 溶液的制备

1.2.1 对照品溶液分别精密称取一定量的没食子儿茶素、原儿茶酸、表没食子儿茶素、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素、大豆苷、二氢槲皮素、染料木苷、芦丁、芒柄花苷、甘草素、大豆苷元、毛蕊异黄酮、柚皮素、染料木素、山柰酚、异甘草素、芒柄花素、美迪紫檀素、樱黄素、鸡蛋黄素对照品,置于5 mL容量瓶中,加甲醇溶解分别配制成0.970、1.042、0.994、0.996、1.035、1.004、1.110、0.980、1.032、0.990、0.988、1.052、1.006、1.010、1.038、1.002、1.006、1.300、1.026、1.135、0.456、1.184 mg·mL-1的对照品储备液,经0.22 μm微孔滤膜滤过,备用。分别取适量的各对照品储备液,加甲醇定容至5 mL配制成混合对照溶液,并逐级稀释,得到一系列不同质量浓度的混合对照工作溶液,使用前保存于4 ℃冰箱。

1.2.2 供试品溶液将样品粉末过50目筛后精密称定1.0 g,置于25 mL具塞锥形瓶中,加入10 mL三氯甲烷-甲醇(4>∶1,体积比)溶液,密闭,称重,室温下超声(功率500 W,频率40 kHz)60 min,放置冷却,再次称重,用三氯甲烷-甲醇(4>∶1)溶液补足失重,过滤,将滤液离心10 min(12 000 r/min)。取上清液,过0.22 μm微孔滤膜后稀释10倍,备用。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件色谱柱XBridge®C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)；柱温：30 ℃；流动相：0.3%甲酸水(A)-甲醇(B)；流速：0.8 mL·min-1；进样量：2.0 μL。洗脱梯度：0～5 min,15%～30%B；5～10 min,30%～40%B；10～13 min,40%～45%B；13～15 min,45%B；15～18 min,45%～55%B；18～23 min,55%～65%B；23～28 min,65%～100%B；28～30 min,100%B。

1.3.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI)；多反应监测(MRM)离子扫描模式检测；离子化温度(TEM)：550 ℃；雾化气(GS1)流速：55 L·min-1；辅助气(GS2)流速：55 L·min-1；气帘气(CUR)流速：40 L·min-1；喷雾电压(IS)：正离子模式下4 500 V,负离子模式下-4 500 V；接口加热,全程通入氮气。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化考察了Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18柱(150 mm×2.1 mm,2.2 μm)、XBridge®C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)、SynergiTMHydro-RP 100 Å柱(2.0 mm×100 mm,2.5 μm)3种色谱柱的分离效果,结果显示,XBridge®C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)具有更好的分离效果和检测灵敏度,故实验选择XBridge®C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)作为色谱柱。进一步考察了以乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇与0.3%甲酸水-甲醇为流动相时的分离效果。结果表明,流动相采用0.3%甲酸水-甲醇时,各色谱峰峰形及分离较好。因此实验选择以0.3%甲酸水-甲醇为流动相。

2.1.2 质谱条件的优化考察了22种待测成分在电喷雾离子源正、负离子模式下的响应,结果表明,原儿茶酸、染料木苷和山柰酚在负离子模式下有较强的响应和更好的峰形,而其他成分与之相反,因此原儿茶酸、染料木苷和山柰酚选择负离子模式,其他成分采用正离子模式进行检测。各成分的保留时间和质谱条件见表2,混合对照溶液的MRM图见图1。

表2 22种目标物的保留时间及优化的质谱条件Table 2 Retention times and optimized MS parameters of 22 analytes

图1 22种目标成分混合对照溶液(10 μg/mL)的MRM图Fig.1 MRM chromatograms of 22 constituents in mixed reference solution(10 μg/mL)the peak numbers denoted were the same as those in Table 2

2.2 供试品制备方法的优化

实验以儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素及芒柄花素色谱峰的峰面积和峰形作为指标,对提取溶剂(30%甲醇/乙醇、50%甲醇/乙醇、70%甲醇/乙醇、90%甲醇/乙醇、三氯甲烷-甲醇(4>∶1))、药液比(1>∶10、1>∶20、1>∶30、1>∶40)和提取时间(30、60、90 min)进行单因素考察,结果表明以三氯甲烷-甲醇(4>∶1)作为提取溶剂、药液比为1>∶10、提取时间为60 min时,上述5种成分的色谱峰峰面积较大且峰形较好。综上,最优制备方法为：三氯甲烷-甲醇(4>∶1)为提取溶剂,药液比为1>∶10,提取时间为60 min。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系、检出限与定量下限精密吸取“1.2.1”中不同质量浓度的混合对照工作溶液,按“1.3”色谱-质谱条件进样分析,通过绘制对照品的峰面积(Y)与相应质量浓度(X,ng·mL-1)的关系曲线,得到回归方程、相关系数和线性范围。结果显示，各化合物在对应质量浓度范围内呈良好的线性关系(r≥0.999 0)。在相同的色谱条件下,分别以约3倍和10倍信噪比确定各成分的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)。结果显示22种成分的LOD为0.07～7.99 ng·mL-1,LOQ为0.22～26.63 ng·mL-1(见表3)。

2.3.2 精密度、重复性与稳定性精密吸取一定质量浓度的混合对照品溶液2 μL,按本方法在1 d内重复进样6次,分别计算各成分峰面积的相对标准偏差(RSD),作为日内精密度；取上述混合对照品溶液连续3 d每天重复进样3次,分别计算各成分峰面积的RSD,作为日间精密度。结果表明,22种目标成分的日内RSD为0.60%～4.8%,日间RSD为0.90%～4.5%,说明仪器精密度良好(见表3)。

分别称取同一鸡血藤样品粉末6份,按“1.2.2”方法制备供试品溶液,分别吸取2 μL进样分析,计算得22种目标成分含量的RSD为0.70%～4.5%,表明该方法重复性良好；在不同时间间隔(0、2、4、8、12、24 h)对同一样品进行分析,测得22种目标成分峰面积的RSD为0.50%～4.3%,表明供试品溶液在24 h内具有较好的稳定性。

2.3.3 加标回收率实验精密称定9份已知含量的样品,每份约0.5 g,置于具塞锥形瓶中,分别按已知含量的80%、100%、120%加入一定量的各对照品溶液(每个水平3份),按“1.2.2”制备加标回收供试品溶液,并按上述色谱-质谱条件进样测定后,计算各成分的平均回收率及RSD。22种目标成分的平均回收率为96.8%～103%,RSD为0.80%～4.4%,表明该方法的准确度良好(见表3)。

表3 22种目标成分的线性范围、检出限、定量下限、精密度及加标回收率实验结果Table 3 Linear ranges,limits of detection,limits of quantitation,precisions and recovery experimental results of 22 compounds

(续表3)

图2 高要、越南、老挝产区不同韧皮部环数鸡血藤中22种目标成分总含量的柱状图Fig.2 Histogram of 22 target components in Spatholobi Caulis with different phloem ring numbers from Gaoyao,Vietnam and Laos

2.4 样品含量测定

吸取2 μL供试品溶液注入液相色谱-质谱仪,按上述条件测定,根据线性方程分别计算供试品溶液中待测目标成分的含量。对高要、越南、老挝3个产区鸡血藤中所测成分总含量进行柱状图分析(如图2),结果表明不同产地之间鸡血藤中各成分的总含量存在一定差异,其中高要产区的总含量整体高于越南和老挝两产地。

3个产区不同韧皮部环数鸡血藤中的原儿茶酸含量和黄酮类成分总含量见图3。由图3可知,3个产地鸡血藤各样品中原儿茶酸的含量均高于黄酮类成分总含量,且原儿茶酸与两类成分总含量的变化趋势基本一致。高要、越南、老挝三产区分别以韧皮部环数10环、8环、9环的鸡血藤中指标成分含量较高。高要产区不同韧皮部环数鸡血藤,指标成分总量几乎随韧皮部环数增加而上升；越南产区不同韧皮部环数鸡血藤,3～8环的指标成分总量随韧皮部环数增加而上升；而老挝产区不同韧皮部环数鸡血藤,指标成分总量呈锯齿形变化。整体而言,鸡血藤韧皮部环数与多指标成分含量具有一定的正相关性。

图3 不同产区不同韧皮部环数鸡血藤中原儿茶酸含量和黄酮类成分总含量的动态变化图Fig.3 Dynamic changes of protocatechuic acid and flavonoids in Spatholobi Caulis with different phloem ring numbers from different regionsA.Gaoyao，B.Vietnam，C.Laos;flavonoids,protocatechuic acid,flavonoids+protocatechuic acid

2.5 主成分分析

主成分分析根据多个变量之间的相关关系和某种线性组合进行转化,得到少数几个保留较多信息且之间不相关的综合变量,其目的是构造输入变量的少数线性组合,尽量多地解释数据的变异性[21]。

本文采用SPSS 22.0统计软件,将不同韧皮部环数的鸡血藤药材中22个成分的定量结果组成矩阵,数据经标准化处理后进行主成分分析。主成分分析中特征值及贡献率结果如下：第一主成分的特征值和方差贡献率分别为6.927和31.486%；第二主成分的特征值和方差贡献率分别为5.711和25.957%；第三主成分的特征值和方差贡献率分别为3.620和16.459%；第四主成分的特征值和方差贡献率分别为1.527和6.939%；第五主成分的特征值和方差贡献率分别为1.386和6.298%；其他主成分特征值的贡献率依次减少。前5个主成分的累积贡献率达87.139%,且特征值均大于1,能较客观地反映不同韧皮部环数鸡血藤药材的综合质量,故选取前5个主成分进行分析。

每个主成分均为原始变量的线性组合,线性组合中各变量对主成分的影响用载荷表示,载荷绝对值越大,表明其影响越大[22]。由表4可知,在第一主成分中,没食子儿茶素、染料木苷和芒柄花苷的因子载荷量最大；第二主成分主要反映了甘草素和异甘草素的信息；在第三主成分中毛蕊异黄酮的载荷因子较大；第四主成分中芦丁的载荷量较大,是对第四主成分影响较大的特征向量；第五主成分主要反映了樱黄素和原儿茶酸的信息，此外，山柰酚和芒柄花素对第五主成分有较强的逆负荷。前5个主成分基本包含了大部分成分的信息。

表4 鸡血藤药材中各成分旋转变换后的因子载荷矩阵Table 4 Rotated factor load matrix of each constituent in Spatholobi Caulis

不同鸡血藤样品的主成分各因子总得分见表5,可根据各主要因子的权重系数计算得出各样品的综合得分。权重系数由其方差贡献的大小决定,各主成分的贡献率与5个主成分的总贡献率之比则为权重系数,如第一主成分的权重系数应为31.486%/87.139%=0.361 3,同理第二、三、四、五主成分的权重分别为0.297 9、0.188 9、0.079 6、0.072 3。各主成分因子得分与其权重系数乘积之和相加即为鸡血藤样品的总因子得分F,其表达式为F=0.361 3F1+0.297 9F2+0.188 9F3+0.079 6F4+0.072 3F5,其值越高,表明综合质量越好。由表5可知,高要产区10环、9环的鸡血藤样品综合得分较高,药材整体质量优于其3～8环的药材；越南产区7～10环的鸡血藤药材质量优于3～6环的药材；老挝产区4环、9环、10环的鸡血藤药材质量优于其它环数的药材。相对而言,老挝产区的所有环数的鸡血藤药材综合排名均较靠后,药材质量比高要和越南产区差。整体来看,以高要产区韧皮部环数10环、9环的鸡血藤药材综合质量较好。

表5 鸡血藤药材的主成分因子及品质综合评价Table 5 Principal component factors and comprehensive quality evaluation of Spatholobi Caulis

3 结 论

本文建立了同时测定鸡血藤中多种指标成分含量的UFLC-QTRAP-MS/MS方法,并结合PCA分析评价了不同韧皮部环数的鸡血藤药材质量,考察了鸡血藤韧皮部环数与指标成分含量的相关性,从而为根据性状特征评价鸡血藤的药材质量提供了科学依据,亦为阐明中药传统经验精髓“辨状论质”的科学内涵提供了新的思路和方法。