多壁碳纳米管QuEChERS/气相色谱-质谱联用法快速检测黄芪中16种农药

崔丽丽，朴向民，冯志伟，于 营，闫梅霞，郑培和*，姚丽娜

(1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112;2.抚松县参王植保有限责任公司，吉林 长白山 134504;3.吉林省中药材种植(养殖)重点实验室,吉林 长春 130112)

黄芪是豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，味甘，性微温，主要成分为皂苷、多糖和黄酮类，具有保肝利尿，补气固表，健脾补中，抗衰老、抗疲劳，对心脑血管、保护肝脏、增强机体免疫功能等功效[1]，为临床常用药物。建国前，黄芪主要满足中医临床调剂用，随着中成药工业的快速发展，黄芪成为了中成药和保健品原料，国内外市场对其需求日趋增大，我国成为黄芪的主要产地及出口国。然而，近年来中药材农残问题已引起国内外的广泛关注[2]，韩国、日本等对中药材中农药残留限量的相关规定作了很大调整，不仅增加了农药检测种类，还降低了某些常用农药残留限量值；日本肯定列表对未制定限量标准的农药均采取一律标准0.01 mg/kg[3]，这对我国的中药材种植中农药的合理使用及农残检测技术提出了新的挑战。目前，我国2015版《中国药典》规定了黄芪中总六六六(α-BHC、β-BHC、δ-BHC、γ-BHC之和)和总滴滴涕(p,p′-DDE、p,p′-DDD、o,p′-DDT、p,p′-DDT之和)均不得超过0.2 mg/kg，五氯硝基苯不得超过0.1 mg/kg[4]。此外，黄芪病害有白粉病、麻口病、锈病、立枯病、紫纹羽病和根腐病等[5-7]，化学防治常施用多菌灵、甲霜灵、嘧菌酯、咯菌腈等农药[8]。因此，为了打破出口贸易壁垒，亟待建立黄芪中更多品种农药残留的快速检测方法。

目前，农药残留检测的提取方法有超声法、振荡法、均质法、固相萃取、索氏提取及超临界流体萃取等[9-11]，净化方法有浓硫酸磺化法、液液萃取(LLE)、固相萃取净化(SPE)、凝胶渗透色谱净化(GPC)及QuEChERS方法等[12-15]，分析技术为气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)及其串联质谱法等[16-20]。其中QuEChERS法(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe)是基于分散固相萃取发展起来的集萃取和净化为一体的新型前处理方法，已成为美国分析化学家协会标准方法(AOAC 2007.01)[21]和欧洲标准化委员会标准方法(EN 15662)[22]，与SPE和LLE等方法相比能够有效缩短前处理时间，提高检测效率，显著降低了有机溶剂用量，已被广泛用于食品、蔬菜等的农残检测[23-27]，以及食品中药物[28-29]、真菌毒素[30]的检测。多壁碳纳米管是由多层石墨片卷曲而成的碳纳米管，层与层之间呈无序排列，具有比表面积大、传导率高、化学稳定性好、机械强度高等优点，已在农药残留分析中应用较多，且备受重视[31-32]。本研究根据黄芪病害防治及农药使用等实际情况，将多壁碳纳米管与QuEChERS方法相结合，建立了气相色谱-质谱联用测定黄芪中α-六六六、β+γ-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、p,p′-滴滴伊、o,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴滴、p,p′-滴滴涕、甲霜灵、二嗪磷、七氯、嘧菌环胺、腐霉利、顺式氯丹、反式氯丹、咯菌腈16种农药残留的分析方法，并成功用于实际黄芪样品中16种农药残留的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司),ML503、ME204天平(感量分别为0.000 1 g和0.000 01 g,梅特勒公司),TGL-16M型高速离心机(湖南湘仪离心机有限公司),IKA T25均质器(德国IKA公司),LSE6776涡旋混合器(康宁公司)。

乙腈、丙酮、正己烷(色谱纯,美国Fisher公司)；0.22 μm有机相微孔滤膜(北京迪马科技有限公司)；氯化钠、氯化锂、无水硫酸钠(分析纯,北京化学厂)；多壁碳纳米管(MWNTs)A、B、C内径均为5～10 nm,长度为10～30 μm,外径从小到大分别为10～20、20～30、30～50 nm(上海麦克林生化有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)和MgSO4(分析纯,北京迪科马科技有限公司)；实验用水为GB/T 6682规定的一级水。α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、p,p′-滴滴滴、o,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴伊、嘧菌环胺、腐霉利、五氯硝基苯、七氯、二嗪磷、顺氏氯丹、反式氯丹、甲霜灵和咯菌腈农药标准物质纯度均大于99.5%,购于国家标准物质中心。黄芪于2018年9月采集于内蒙古地区,经专家鉴定为膜荚黄芪AstragalusMembranaceus(Fisch.) Bunge。

1.2 标准溶液配制

精密称取50 mg(精确至0.01 mg)各农药标准物质,用乙腈溶解并定容配成质量浓度均为500 μg/mL的单标储备液,于-20 ℃冷冻储存。精密吸取适量各农药单标储备液于25 mL容量瓶中用乙腈定容,使用时逐级稀释成系列混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

鲜黄芪经40 ℃后干燥后取不少于200 g试样,置于高速粉碎机中粉碎,过100目筛3～5次后充分混匀,装入聚乙烯塑料袋中保存。

精确称取已粉碎均匀试样1.0 g(精确至1 mg),加入10 mL水浸泡30 min,再加入20 mL乙腈,高速(3 000 r/min)涡旋振荡提取3 min,加入1.5 g NaCl+6 g MgSO4混匀1 min,以5 000 r/min离心5 min,取上清液5 mL,加入到由75 mg PSA、450 mg MgSO4与20 mg多壁碳纳米管A组成的混合净化剂中,涡旋1 min,混匀,以5 000 r/min离心5 min,取上清液上机检测。

1.4 色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱为HP-5ms石英毛细管柱,30 m×0.25 mm(内径)×0.25 μm(膜厚)；程序升温：初始柱温100 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至130 ℃，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持10 min,最后以10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。进样口温度250 ℃,载气为高纯氦气(纯度>99.999%),流速1.0 mL/min；尾吹气流量29 mL/min,进样体积为1 μL,进样方式为脉冲不分流进样,脉冲压力172 250 Pa,延时0.75 min,0.75 min后开阀。

质谱条件：离子源为电子轰击源(EI),电离能量70 eV,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,溶剂延迟时间10 min,选择离子监测(SIM)模式,传输线温度280 ℃。16种农药的保留时间及检测离子见表1。

表1 16种农药的质量分析参数Table 1 Mass spectrometric parameters for 16 pesticides

图1 优化色谱条件下的农药混合标准溶液的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of pesticides standard solution under optimization chromatographic conditionsthe number 1-20 were the same as those in Table 1

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件优化

选择对弱极性化合物分离较好的毛细管柱色谱柱HP-5ms,通过SCAN模式扫描,选择扫描质量范围为30～500 amu,确定每种农药的保留时间及定性定量离子,并建立SIM离子监测方法。每种农药选择一个定量离子,2个定性离子,按照保留时间顺序分段检测,因β-六六六和γ-六六六两个谱峰重叠,故合并计算为一种农药，优化条件后16种的农药保留时间、定量离子、定性离子见表1,总离子流图见图1。

2.2 萃取剂与萃取盐的选择

2.3 多壁碳纳米管的选择

向空白样品中加入一定量农药混合标准溶液配成0.5 mg/kg的样品溶液，以16种农药的回收率考察“1.1”中A、B、C 3种型号MWCNTs的净化效果。结果显示，A、B、C 3种MWCNTs净化后回收率在70%～120%范围内的农药数量分别为13、10、7种，这是因为MWCNTs的外径越小，其比表面积越大，吸附能力越强，因此选择MWCNTs A进行净化。此外，实验还考察了MWCNTs A的用量(5、10、20、25、30、35、40 mg)对净化效果的影响，发现其用量为20 mg时，回收率在70%～120%范围内的农药数量最多(13种)，因此最终选择20 mg MWCNTs A进行净化。

2.4 净化剂种类及用量的优化

根据本研究所涉及的农药种类和特性，选择N-丙基乙二胺(PSA)+无水MgSO4+ MWCNTs进行组合净化[34]，实验考察了50 mg PSA+300 mg MgSO4+20 mg MWCNTs A、75 mg PSA+450 mg MgSO4+20 mg MWCNTs A和150 mg PSA+900 mg MgSO4+20 mg MWCNTs A的净化效果。结果发现，75 mg PSA+450 mg MgSO4+20 mg MWCNTs A的净化效果最好，此时农药的回收率在70%～120%范围内的数量最多。

2.5 基质效应

基质效应(ME=B/A，A为纯溶剂中农药的响应值，B为样品基质中添加的相同含量农药响应值)大于1.2为基质效应增强，小于0.9为基质效应减弱。本研究中大多数农药均有较强的基质效应，因此选择脉冲不分流进样方式并结合基质匹配标准法来消除基质效应的影响[30]。另外，研究还发现，提取液体积过大时，大多数农药的ME较大，但提取液体积过小时，农药提取不完全，回收率较低。综合考虑，选择提取液体积为5.0 mL，此时所有农药的ME和回收率均在合理范围内。

2.6 方法学考察

分别配制质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的16种农药混合标准工作液，在优化条件下测定。以各农药的定量离子峰面积(y)为纵坐标，对应以质量浓度(x,mg/L)为横坐标绘制标准曲线，分别以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10计算检出限(LOD)和定量下限(LOQ)。另向空白黄芪样品中准确加入一定量16种农药混合标准溶液，使其添加质量分数分别为0.05、0.2、0.5 mg/kg，每个添加水平设定3个平行和1个空白对照，采用本方法测定并计算各农药的加标平均回收率和相对标准偏差(RSD，n=3)。结果显示，α-六六六、β+γ-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、p,p′-滴滴伊、o,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴滴、p,p′-滴滴涕、甲霜灵、二嗪磷、七氯、嘧菌环胺、腐霉利、顺式氯丹、反式氯丹、咯菌腈16种农药在0.01～5.0 mg/L范围内线性良好，相关系数为0.974～1.000，LOD为0.001～0.011 mg/kg，LOQ为0.002～0.035 mg/kg，3个加标水平下的回收率为72.1%～115%，RSD为1.2%～14%。

表2 黄芪中16种农药的线性范围、相关系数、回收率、相对标准偏差、检出限及定量下限Table 2 Linear ranges,correlation coefficients,recoveries,RSDs,LODs and LOQs for 16 pesticides in Astragalus membranaceus

图2 实际样品的色谱图Fig.2 Chromatogram of a actual sample1：α-BHC;2：β+γ-BHC

2.7 实际样品检测

采集内蒙古黄芪种植区内12份生长期鲜黄芪,将其烘干粉碎后在优化条件下测定。结果检出α-六六六、β+γ-六六六,平均含量分别为0.011、0.013 mg/kg,其余农药未检出,其中一份黄芪的色谱图见图2。

3 结 论

本研究采用改进的QuChERS方法结合多壁碳纳米管净化,建立了中药材黄芪中六六六、滴滴涕、五氯硝基苯等16种农药的GC-MS分析方法。该方法的平均回收率为71.9%～115%,RSD为1.2%～14%,完全符合农药残留分析的要求,具有快速、准确、环保的优点,极大地提高了检测效率,也减少了对环境的污染,保障了检验人员的健康。