同位素稀释高效液相色谱-串联质谱法测定水体、底泥、鱼及虾中氯硝柳胺残留量

2020-08-22刘永涛沈丹怡杨秋红杨移斌艾晓辉

分析测试学报 2020年8期

刘永涛，沈丹怡，董靖，杨秋红，杨移斌，周顺，艾晓辉*

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北武汉 430223；2.农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141；3.湖北省水产品质量安全工程技术研究中心，湖北武汉 430223；4.浙江省慈溪市水产技术推广中心，浙江慈溪 315300)

氯硝柳胺(Niclosamide，NIC)，又名杀螺胺、贝螺杀、清塘净等，是世界卫生组织(WHO)推荐使用的灭螺剂。在我国氯硝柳胺主要用于杀灭血吸虫传播的中间宿主钉螺，自1992年世界银行贷款中国血吸虫病控制项目实施以来，每年用药量约3 200 t以上，大量氯硝柳胺在江湖洲滩长期反复使用[1]。氯硝柳胺在我国也被批准用作清塘剂杀灭钉螺、椎实螺和野杂鱼等[2]。研究表明，氯硝柳胺对鱼类、蚤类、蝌蚪、螺类等具有明显毒性[3]。Abreu等[4]通过研究氯硝柳胺与小牛胸腺DNA的相互作用，证实氯硝柳胺能引起DNA的损伤。Ostrosky-Wegman等[5]研究发现4个人类血液样品中有2个样品的碎屑形成与氯硝柳胺呈剂量相关增长。氯硝柳胺在人体内也能诱导产生血管舒张相关的副作用[6]。持续大范围、大剂量使用氯硝柳胺对生态环境和消费者身体健康的影响日益受到人们关注，同时在水产养殖中氯硝柳胺的投毒案件也时有发生[7]，因此，建立一种对环境水体、底泥、鱼和虾中氯硝柳胺准确定性定量的分析方法是十分必要的。

目前对环境水体中氯硝柳胺的测定方法主要有高效液相色谱法[8]、衍生化气相色谱-质谱法[7]和液相色谱-串联质谱法[9-11]；底泥中氯硝柳胺的测定方法有加速溶剂萃取/液相色谱-串联质谱法[12]；水产品中氯硝柳胺的测定方法主要有气相色谱法[13]、高效液相色谱法[14]和液相色谱-串联质谱法[15-17]。气相色谱法与气相色谱-质谱法需进行硅烷化衍生处理，且样品前处理过程繁琐；液相色谱法分析氯硝柳胺易出现假阳性，且检出限高；液相色谱-串联质谱法灵敏度高，但存在明显的基质效应，且不同基质的基质效应差别较大。同位素稀释结合质谱技术是有效减少基质效应的方法[18-19]。因此，本文以氯硝柳胺的稳定同位素标记物氯硝柳胺-13C6(NIC-13C6)为内标，建立了检测环境水体、底泥、鱼和虾中氯硝柳胺的同位素稀释高效液相色谱-串联质谱法。与前述文献方法相比，该方法具有灵敏度和准确度高、样品制备简单、无基质效应等优点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ Quantum Access Max液相色谱-质谱联用仪(Thermo Fisher Scientific公司)；HITACHI 20PR-520型自动高速冷冻离心机(日本日立公司)；Mettler-Toledo AE-240电子天平(梅特勒-托利多公司)；FS-1高速匀浆机(华普达教学仪器有限公司)；调速混匀器(上海康华生化仪器制造厂)；氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)；HQ-60-Ⅱ 旋涡混合器(北京北方同正生物技术发展有限公司)；HGC-12氮吹仪(上海HENGAO T&D公司)。

氯硝柳胺标准品(纯度≥96%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)、氯硝柳胺-13C6-水合物标准品(纯度≥99.5%，德国Witega公司)；十八烷基硅胶(C18)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(40～60 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；多壁碳纳米管(MWCNTs)(外径：8～15 nm，纯度>95%，长度<50 μm，北京博宇高科新材料技术有限公司)；乙腈、甲醇、水(色谱纯，美国J.T.Baker公司)，氨水、无水硫酸钠、氯化钠(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；0.1%氨水乙腈：1 000 mL乙腈中加入2 mL 50%氨水，混匀即得。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取适量氯硝柳胺、氯硝柳胺-13C6-水合物标准品，用乙腈分别溶解并定容，配制成100 μg/mL的标准储备液，于-20 ℃冰箱中保存。分别用乙腈-水(70>∶30,体积比)将标准储备液稀释成1.0 μg/mL的标准中间液，于4 ℃冰箱中保存。

用乙腈-水(70>∶30)稀释标准中间液，得到含氯硝柳胺质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L，且含氯硝柳胺-13C6质量浓度均为10 μg/L的溶剂标准工作溶液。

采用“1.3”的方法制备水样、底泥、黄颡鱼自然比例带皮肌肉和克氏原螯虾肌肉空白样品溶液，用空白样品溶液稀释标准中间液，得氯硝柳胺质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L，且含氯硝柳胺-13C6质量浓度均为10 μg/L的空白基质匹配标准溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1 水样移取200 mL水样于500 mL分液漏斗中，加入10 μL 1.0 μg/mL的内标溶液，再加入8 g氯化钠，振摇分液漏斗使其溶解。加入氨水调节水样的pH为9.5±0.5，再加入40 mL乙酸乙酯剧烈振荡混匀2 min，静置30 min，取上层乙酸乙酯层于鸡心瓶中，用乙酸乙酯重复提取1次。将乙酸乙酯层合并于鸡心瓶中，置于40 ℃旋转蒸发仪上旋转蒸发至干，用4 mL乙腈分2次溶解残渣并转移至10 mL离心管中，置于50 ℃氮吹仪上氮吹至干，加入1 mL乙腈-水(70>∶30)定容，涡旋振荡30 s，7 000 r/min离心5 min，过0.22 μm尼龙有机滤头后待分析。

1.3.2 底泥去除底泥样品中的树枝、石头等杂物后烘干。称取5 g粉碎的干燥样品于50 mL离心管中，加入3 mL蒸馏水，涡旋振荡1 min，再加入20 μL 1.0 μg/mL的内标溶液和7 mL 0.1%氨水乙腈，涡旋振荡30 s，再加入3 g无水硫酸镁涡旋振荡1 min，7 000 r/min离心5 min，转移提取液至15 mL离心管中，重复提取1次，合并提取液，用乙腈定容至15 mL，再加入300 mg C18粉，涡旋振荡30 s，7 000 r/min离心5 min。准确移取7.5 mL提取液至10 mL离心管中，置于50 ℃氮吹仪上氮吹至干，用1 mL乙腈-水(70>∶30)溶解残渣，涡旋振荡30 s，7 000 r/min离心5 min，取离心后的液体过0.22 μm尼龙有机滤头后待分析。

1.3.3 鱼、虾样品分别称取5 g黄颡鱼自然比例带皮肌肉和克氏原螯虾肌肉样品，置于50 mL离心管中，依次加入20 μL 1.0 μg/mL的内标溶液和7 mL 0.1%氨水乙腈，后续步骤与“1.3.2”相同。

1.4 色谱与质谱分析条件

色谱条件：色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)；柱温：35 ℃，流速：0.3 mL/min；流动相：A为乙腈，B为水；进样量：10 μL。流动相洗脱梯度：0～2.0 min，50% A；2.0～2.5 min，50%～90% A；2.5～6.5 min,90%A;6.5～6.6 min，90%～50% A；6.6～7.5 min，50% A。

质谱条件：离子化模式：加热大气压电喷雾离子源(HESI)，选择反应监测(SRM)模式进行检测，负离子模式喷雾电压：-3 000 V，源内解离电压：0 V，蒸发气温度：200 ℃，鞘气压力：344.7 kPa，辅助气压力：34.5 kPa，碰撞气及压力：氩气，0.195 Pa，离子传输毛细管温度：350 ℃，Q1 PW 0.4，Q3 PW 0.7。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

分别将5.0 μg/mL的氯硝柳胺和氯硝柳胺-13C6标准溶液以10 μL/min的速度注射到质谱仪，分别对其母离子进行扫描，发现氯硝柳胺和氯硝柳胺-13C6在负离子模式下产生更多的[M-H]-分子离子，这与两者含有高电负性的氯原子有关[18]，母离子分别为m/z324.9和331.0，因此选择在负离子模式下进行分析。然后以子离子扫描方式进行二级质谱分析，分别找出其定量和定性子离子及对应的碰撞能量，结果见表1。氯硝柳胺的产物离子分别为m/z289.0和171.1，分别由氯硝柳胺损失1个HCl和[324.9-HCl]-损失1个C7H3O2得到；氯硝柳胺-13C6则损失1个HCl产生m/z294.9的子离子和[331.0-HCl]-损失1个C7H3O2产生m/z176.9的子离子。

与电喷雾离子源(ESI)相比，HESI采用设定蒸发气温度来提高辅助气温度进而起到加热的作用，因而离子化效率和重现性比ESI源好，且灵敏度有所提高[19]。本研究比较了HESI不同蒸发气温度(50、100、200、350、450 ℃)对10 μg/L目标物检测灵敏度和鞘气压力的影响。结果显示，随着HESI蒸发气温度的提高，氯硝柳胺和氯硝柳胺-13C6的峰面积均有提高，鞘气压力也随之增加。蒸发气温度为450 ℃时两者的峰面积分别约为50 ℃时的2.2倍、2.5倍，鞘气压力约为50 ℃时的2.1倍。考虑到鞘气压力升高需要消耗更多的氮气，同时兼顾检测灵敏度，本实验选择蒸发气温度为200 ℃。

表1 目标化合物的SRM监测离子对及其质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for SRM monitoring ion pairs of target compounds

2.2 色谱条件的优化

目前，液相色谱-质谱法分析氯硝柳胺的流动相有乙腈-0.1%氨水[9]、乙腈-0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液[17]、乙腈-水[8,11,15-16]和甲醇-水[10,12]。本实验对上述流动相进行了筛选。结果表明，采用乙腈-0.1%氨水或乙腈-0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相时，氯硝柳胺和氯硝柳胺-13C6的保留时间易漂移，且目标物的离子化也不稳定，导致连续两次测定同一样品时目标物的峰面积相差较大，与文献研究结果相同[15-16]。而以乙腈-水为流动相比以甲醇-水为流动相时目标物的响应度高，因此最终选择乙腈-水为流动相。

2.3 样品前处理条件的优化

2.3.1 提取剂的选择水样中氯硝柳胺的提取剂有非离子表面活性剂Triton X-114[8]、离子对试剂[C8MIM][PF6]-乙腈[9]、乙腈-二氯甲烷[11]和三氯甲烷[13]。但Triton X-114和[C8MIM][PF6]的价格较高，且可处理的水样体积较小导致检出限较高；二氯甲烷和三氯甲烷的毒性较大，且浓缩过程中易爆沸。此外，由于氯硝柳胺的pKa为7.3，呈弱碱性，碱性环境有利于氯硝柳胺呈分子状态，从而更易溶于非极性溶剂乙酸乙酯中。因此，本方法先将水样的pH调至碱性，再以毒性小且沸点较高的乙酸乙酯作为提取剂进行提取。

廖且根等[12]采用乙腈-水作为萃取溶剂，中性氧化铝、硅藻土作为吸附材料，利用加速溶剂萃取仪对底泥样品中的氯硝柳胺及其降解产物进行提取。该方法需专门提取设备，提取过程较复杂。水产品中氯硝柳胺的提取剂多采用氨化乙腈[15-17]，但上述文献只给出氨化乙腈的pH值。由于乙腈为有机溶剂，用氨水调节pH时其pH值难于测定，因此比较了在乙腈中添加不同体积分数(0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1%)氨水对底泥、黄颡鱼自然比例带皮肌肉和克氏原螯虾肌肉中氯硝柳胺加标(5 μg/kg)提取回收率的影响。结果表明，乙腈中添加0.1%氨水时，氯硝柳胺的提取回收率最高(约为79.7%)。因此，水样以乙酸乙酯作为提取剂，底泥、鱼、虾以0.1%氨水乙腈作为提取剂。

图1 不同吸附剂对样品提取液的净化作用Fig.1 Effects of different adsorbents on extraction solutions

2.3.2 净化吸附剂及其用量的选择底泥和鱼、虾基质复杂，底泥中含有腐殖质和色素等杂质，鱼、虾含有脂肪和蛋白质等，因此样品在提取后需进一步净化。在底泥、黄颡鱼自然比例带皮肌肉、克氏原螯虾肌肉空白样品中分别添加氯硝柳胺，使其加标浓度为5 μg/kg。按照“1.3”方法进行提取后，以回收率作为评价指标，分别考察了100 mg的MWCNTs、C18和PSA对提取液的净化效果(见图1)。结果显示，C18对底泥、黄颡鱼、克氏原螯虾肌肉样品提取液的净化效果最优，PSA最差。这是由于PSA吸附剂的硅胶上键合了乙二胺-N-丙基官能团，与氨基(NH2)吸附剂相似，因此对氯硝柳胺的吸附作用最大。进一步对比了不同用量C18(100、200、300 mg)对提取液的净化效果，结果表明，C18用量为300 mg时的净化效果最优，因此选择300 mg C18作为净化吸附剂。

2.4 线性关系

2.4.1 溶剂标准曲线将“1.2”制备的溶剂标准工作溶液进样分析，以氯硝柳胺的质量浓度为横坐标(x，μg/L)，氯硝柳胺与氯硝柳胺-13C6的峰面积比为纵坐标(y)，绘制溶剂标准曲线。结果表明，氯硝柳胺在0.2～200 μg/L质量浓度范围内呈良好线性，回归方程为y=0.192 2x+0.022 5，相关系数(r2)为0.999 5。

2.4.2 基质匹配标准曲线将“1.2”制备的水样、底泥、黄颡鱼自然比例带皮肌肉、克氏原螯虾肌肉空白基质匹配标准溶液进样分析，以氯硝柳胺的质量浓度为横坐标(x，μg/L)，样品中氯硝柳胺与氯硝柳胺-13C6的峰面积比为纵坐标(y)，绘制基质匹配标准曲线。结果表明，氯硝柳胺在0.2～200 μg/L质量浓度范围内呈良好线性，回归方程分别为y水样=0.188 5x水样-0.069 6，y底泥=0.167 1x底泥-0.101 6，y鱼=0.178 6x鱼-0.021 7和y虾=0.191 2x虾+0.023 3，相关系数(r2)分别为0.999 6、0.999 8、0.999 7和0.999 9。

2.5 基质效应

液相色谱-质谱联用技术在生物样品分析中普遍存在基质效应。同位素内标与待测物结构相似，在色谱和质谱上的特征相似，不但可抵消质谱离子化时的基质效应，还可消除样品前处理过程中的差异。本研究采用氯硝柳胺-13C6作为内标，以水样、底泥、黄颡鱼自然比例带皮肌肉和克氏原螯虾肌肉的基质匹配标准曲线与氯硝柳胺溶剂标准曲线的斜率来考察基质效应。基质效应的计算公式为[1-(基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)]×100%，若为负值，表明存在基质增强作用，为正值则表明存在基质抑制作用[20]。结果显示，上述4种基质匹配标准曲线的斜率与溶剂标准曲线斜率的比值分别为0.98、0.87、0.93、0.99，表明4种基质对氯硝柳胺均为抑制作用。且斜率比值在0.8～1.2范围内，说明4种基质对氯硝柳胺无基质效应[21]。因此，本文采用溶剂标准曲线对氯硝柳胺进行定量。

2.6 方法回收率、相对标准偏差、检出限与定量下限

在空白水样中添加2.5、25、250 ng/L 3个水平的氯硝柳胺，每个浓度水平做6个平行样品，按照“1.3.1”进行样品前处理，“1.4”条件进行测定，得3个加标水平下氯硝柳胺的平均回收率为90.5%～109%，相对标准偏差(RSD)为3.2%～11%。在空白底泥、黄颡鱼自然比例带皮肌肉和克氏原螯虾肌肉中分别添加0.5、5.0、50 μg/kg的氯硝柳胺，每个浓度水平做6个平行样品，按照“1.3.2”和“1.3.3”进行样品前处理，“1.4”条件进行测定，得3种样品的平均回收率分别为89.4%～113%、92.8%～110%和94.1%～107%，RSD分别为4.6%～12%、2.8%～11%和3.2%～9.3%。

分别以大于3倍和10倍信噪比计算检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，氯硝柳胺在水样中的LOD为1.0 ng/L，LOQ为2.5 ng/L，底泥、黄颡鱼自然比例带皮肌肉和克氏原螯虾肌肉样品的LOD为0.2 μg/kg，LOQ为0.5 μg/kg。空白黄颡鱼自然比例带皮肌肉及加标回收样品(5 μg/kg)的SRM色谱图见图2。