氧化锌QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中7种林可酰胺类与大环内酯类兽药残留

杨 明，伊 鋆，陈 丹，王梦颖，许 晴，田 甜，管卓龙，侯 靖，周 原，刘 坤，王冬梅，胡筱静，卢跃鹏，江小明，涂凤琴

(武汉食品化妆品检验所，湖北 武汉 430012)

我国是蜂蜜的生产大国之一[1]。兽药在防治疾病、降低病死率、提高养殖效率和保障产品产量等方面发挥了巨大作用，有效推动了蜜蜂养殖产业的规模化发展。然而兽药使用不合理、禁限用兽药滥用等问题时有发生，导致蜂产品中存在一定程度的兽药残留，从而影响人体健康，甚至阻碍我国蜂蜜的出口。林可酰胺类兽药主要包括林可霉素和克林霉素，其对厌氧菌作用强，对革兰氏阳性菌等有效。大环内酯类兽药根据内酯环结构母核上碳数分为14、15和16三类，对需氧型革兰氏菌具有广泛作用。这两类兽药在防治蜜蜂疾病方面效果好，特别是针对蜜蜂的美洲幼腐病等，从而被广泛用于蜜蜂疾病的预防和治疗[2]。但不合理使用和不遵守休药期等会造成蜂蜜兽药残留问题，进而引起人体肠道紊乱、腹泻等胃肠道不良反应，损害前庭和耳蜗神经，甚至造成肝肾严重损伤[3-5]。目前关于蜂蜜中林可酰胺类和大环内酯类兽药残留的限量，世界各国暂未明确。因此，建立蜂蜜中林可酰胺类和大环内酯类兽药残留的分析方法对于监测蜂蜜中兽药残留情况以及保障蜂蜜的食品安全具有实际意义。

目前，林可酰胺类和大环内酯类兽药的测定方法主要有液相色谱法(HPLC)[6]和液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[7-9]。HPLC法前处理复杂、定性能力较弱，灵敏度低；HPLC-MS/MS法的选择性和灵敏度高，抗干扰性强，在食品、环境和医学等领域应用广泛。前处理技术主要采用固相萃取法，但操作步骤繁琐、试剂用量大，不适于批量样品检测。传统QuEChERS法多采用C18、PSA和GCB等吸附材料单独或联用的方式进行净化处理，但对于蜂蜜样品的处理效果均不理想。

氧化锌(ZnO)是一种新型吸附剂，其带隙宽、化学性质稳定，由于原子的反应性高，通过共用电子可引起较强的分子间作用力，从而产生吸附效应。同时其比表面积和吸附容量大，目前在吸附废水中有机物[10]和重金属[11]等方面应用广泛，而在食品中的应用未见文献报道。本实验采用新材料ZnO与N-丙基乙二胺(PSA)按照一定配比，基于QuEChERS原理对蜂蜜样品进行前处理，结合HPLC-MS/MS的高灵敏度和强抗基质干扰等特点，建立了蜂蜜中7种林可酰胺类以及大环内酯类兽药残留的快速检测方法。该方法操作简单，重复性好，分析快速，针对蜂蜜中兽药残留问题提供了可靠的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SCIEX 4500 Triple Quad质谱仪(配Turbo V离子源，美国 AB SCIEX公司)；LC 30A液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；超声波清洗器(美国 Kudos公司)。

林可霉素(CAS：154-21-2)、克林霉素(CAS：18323-44-9)、替米考星(CAS：108050-54-0)、红霉素(CAS：114-07-8)、罗红霉素(CAS：80214-83-1)、螺旋霉素(CAS：8025-81-8)、吉他霉素(CAS：1392-21-8)均为First Standard标准品，纯度均≥97.0%。

乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸铵、甲酸、氨水(均为HPLC级，购于GER Merck KgaA集团)；石墨化炭黑(GCB)、氨基(NH2)吸附剂、中性氧化铝(Al2O3-N)、N-丙基乙二胺(PSA)、氧化锆(ZrO2)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、氧化锌(ZnO)和弗罗里硅土(Florisil)(购于GER CNW公司)；磷酸氢二钠、氯化钠、无水硫酸镁和无水硫酸钠(均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 标准溶液配制

准确称取一定量的7种待测兽药标准品于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配制成质量浓度为10 μg/mL的标准储备液，于-18 ℃下储存。临用时以空白样品基质提取液配制成系列质量浓度的标准工作溶液，用于制作标准曲线。

1.3 样品前处理

准确称取2.0 g样品置于50 mL离心管中，加入3 mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)，涡旋使其充分溶解，再加入2 g无水硫酸钠和10 mL 1%氨水乙腈，涡旋振荡，超声15 min后离心(3 900 r/min)3 min。取全部上清液于15 mL离心管(预先装有80 mg ZnO+20 mg PSA)中，涡旋1 min，离心后过聚四氟乙烯(0.22 μm)滤膜待测。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件色谱柱：Waters XBridge C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水，B为乙腈；柱温：45 ℃；进样量：3 μL。梯度洗脱程序：0～1.0 min，5% B；1.0～3.5 min，5%～45% B；3.5～5.5 min，45%～90% B；5.5～8.0 min，90% B；8.0～8.1 min，90%～5% B；8.1～11.0 min，5% B。

1.4.2 质谱条件离子源：电喷雾电离正离子模式(ESI+)；雾化气(GS1)和辅助气(GS2)压力均为344 750 Pa(50 psi)；离子源温度(TEM)：500 ℃；气帘气压力(CUR)：172 375 Pa(25 psi)；电离电压(IS)：5 000 V；碰撞气体(CAD)：Medium；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

利用针泵进样将100 ng/mL的7种待测兽药标准溶液注入质谱仪，分别将母离子在ESI+和ESI-两种模式下进行全扫描，结果显示ESI+模式下7种待测物的离子信号稳定、响应高，因此选择ESI+扫描模式。在该模式下7种化合物均产生[M+H]+、[M+2H]2+的母离子。再进一步扫描产生的二级碎片离子，选取其中丰度比最高的2个作为定性、定量分析的离子对。目标化合物的质谱条件如表1所示。

表1 7种林可酰胺类和大环内酯类兽药的质谱参数Table 1 MS parameters of 7 lincosamide and macrolide veterinary drugs

2.2 色谱条件的优化

采用Waters XBridge C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)色谱柱，在ESI+模式下，比较了7种目标物在乙腈-水与甲醇-水流动相体系中的色谱行为。实验发现，7种目标物在乙腈-水流动相中的峰形和响应均优于甲醇-水，且洗脱时间短，故选择乙腈-水流动相体系。

流动相中加入适量挥发性盐或酸，可以提高检测物的响应值、分辨率和改善峰形[12]。因此，在水相中加甲酸或乙酸铵进一步优化流动相体系的条件。结果发现，因7种目标物离子化后主要以[M+H]+或[M+2H]2+的形式存在，故在水相中加入甲酸时，各目标物的质谱响应高，且以加入0.1%甲酸时的效果最佳；而在水相中加入1.0、2.0、5.0 mmol/L乙酸铵时，各目标物的响应均有所降低。因此，实验采用0.1%甲酸水-乙腈作为流动相。

2.3 提取溶剂的优化

林可酰胺类和大环内酯类兽药的极性较大，易溶于极性溶剂[13-14]，因此实验比较了乙腈、甲醇、乙酸乙酯和丙酮作为提取溶剂时的提取效率。结果显示，甲醇提取液的水分较多且不易分层，不利于目标物的分析；乙酸乙酯作为提取溶剂时，乳化现象严重，回收率偏低；丙酮作为提取溶剂时，挥发性较强，且直接进样会损伤管道和质谱元件；而乙腈对糖的溶解性较小且有沉淀蛋白的作用[15]，各目标物的回收率均优于甲醇、乙酸乙酯和丙酮。故实验选择乙腈作为提取溶剂，进一步考察了纯乙腈、5%氨水乙腈、2%氨水乙腈、1%氨水乙腈、5%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈和1%甲酸乙腈的提取效果。结果表明：7种目标化合物在上述提取溶剂中的平均回收率无明显差异，分别为81.2%、79.9%、83.3%、88.5%、74.9%、78.4%和73.6%，但林可霉素以2%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈为提取溶剂时的回收率分别为49.1%和22.2%；红霉素以5%甲酸乙腈为提取溶剂时的回收率仅为25.0%。相比之下1%氨水乙腈作为提取溶剂时的平均回收率最高，特别是林可霉素的回收率均高于其它6种提取溶剂，且7种目标物的回收率在76.9%～102%之间，完全满足实验要求。因此实验采用1%氨水乙腈作为提取溶剂。

2.4 吸附剂的优化

蜂蜜含有丰富的糖类、氨基酸、有机酸和少量蛋白质等[16]，可能影响目标化合物的测定，同时还会污染离子源。因此实验考察了质量均为100 mg的PSA、C18、GCB、NH2、Al2O3-N和Florisil等QuEChERS 常用净化剂，以及ZrO2和ZnO等新材料对目标化合物的净化效果和回收率。

图1 不同吸附剂对目标物回收率的影响Fig.1 Effect of different adsorbents on the recoveries of the target analytes

图2 不同吸附剂组合对目标物回收率的影响Fig.2 Effect of combinations of different adsorbents on the recoveries of the target analytes

结果表明(见图1)，ZrO2作为能有效吸附磷脂类物质的吸附剂，同时也能吸附目标物，而蜂蜜基质中不含磷脂类物质，因此各目标物的平均回收率最低，仅为7.69%；PSA、C18、GCB、NH2、Al2O3-N、Florisil和ZnO作为吸附剂时各目标物的平均回收率分别为72.2%、56.5%、68.3%、68.7%、67.9%、60.0%和67.2%，经各吸附剂净化后个别目标物的回收率偏低，可能是吸附剂对各目标物均有不同程度的吸附。通过分析发现，PSA作为吸附剂时螺旋霉素和吉他霉素的回收率较低(分别为30.9%和24.9%)，而其它5种目标物的回收率均在83.9%～93.3%之间；ZnO作为吸附剂时能有效吸附蜂蜜基质中的糖类物质，其中螺旋霉素和吉他霉素的回收率达到最高(分别为90.5%和91.5%)，而林可霉素、红霉素和罗红霉素的回收率分别为28.7%、44.9%和44.4%。可能由于ZnO的吸附能力强且用量较高从而吸附部分目标物，导致其回收率偏低。

进一步考察了不同比例的ZnO和PSA两种吸附剂组合的净化效果(见图2)。结果表明，提取液经组合吸附剂净化后的效果好，各目标物的平均回收率均显著提高，同时有效降低了单一吸附剂对不同目标物的吸附。其中80 mg ZnO+20 mg PSA 的净化效果最好，各目标物的回收率为75.4%～96.7%，平均回收率为85.6%，均优于其它组合。故实验最终采用 80 mg ZnO+20 mg PSA的组合吸附剂对样品进行净化。

2.5 盐析剂的优化

蜂蜜基质含有18%～22%水分，且在前处理时需加入磷酸盐缓冲液调节pH值和溶解基质样品，故在样品提取时应加入盐析剂使有机相和水相分层，以达到除水目的。NaCl、MgSO4和Na2SO4是常用的盐析剂，实验分别考察了2 g NaCl、2 g MgSO4、2 g Na2SO4、1 g NaCl+1 g MgSO4、1 g NaCl+1 g Na2SO4、1 g MgSO4+1 g Na2SO46种盐析剂对目标化合物回收率的影响。结果表明，NaCl、MgSO4、NaCl+MgSO4、NaCl+Na2SO4、MgSO4+Na2SO4作为盐析剂时的平均回收率分别为68.8%、64.4%、53.0%、68.6%、60.4%，各目标化合物的平均回收率偏低，其中林可霉素、螺旋霉素和吉他霉素的回收率不满足实验要求；而Na2SO4作为盐析剂时的平均回收率为87.4%，且林可霉素、螺旋霉素和吉他霉素的回收率明显提升。因此实验选择2 g Na2SO4作为盐析剂。

2.6 其他条件的选择

蜂蜜样品富含有机酸而呈弱酸性，林可酰胺类和大环内酯类兽药可稳定于pH 6～8溶液中，在酸性或碱性条件下均不稳定，特别是林可霉素、红霉素和螺旋霉素对酸比较敏感，在酸性条件下易降解。故采用pH 8的磷酸盐缓冲液调节蜂蜜样品pH值至中性，同时也能起到水解蜂蜜样品和沉淀蛋白的作用，并有效避免目标物在提取过程中降解，从而提升回收率。考察了添加不同体积磷酸盐缓冲液(3、4、5、6、7、8、9 mL)对样品溶液pH值的影响，结果显示，样品溶液pH值随磷酸盐缓冲液添加量的变化不大，均在7～8之间，因此实验选择添加3 mL磷酸盐缓冲液。

实验发现0.22 μm尼龙滤膜对替米考星和螺旋霉素存在明显吸附，影响其回收率，而0.22 μm的聚四氟乙烯(PTFE)滤膜对目标物无明显吸附现象，因此实验采用PTFE材料的过滤膜。

2.7 基质效应

基质效应(ME)是指目标化合物在离子化时受到基质干扰物的竞争引起分析信号变化从而导致增强或抑制的效应。采用下式评价基质效应：ME=K1/K2，其中K1和K2分别为基质标准曲线斜率和溶剂标准曲线斜率，当ME>1.15时，表明产生基质增强效应；当ME<0.85时，表明产生基质抑制效应；当ME为0.85～1.15时，说明基质效应不明显[17]。实验对7种目标物的基质效应进行了评价。结果表明，林可霉素、克林霉素、替米考星和螺旋霉素的基质效应分别为1.17、1.27、1.64和1.62，均大于1.15，说明存在一定的基质增强效应；而红霉素、罗红霉素和吉他霉素的基质效应均在0.85～1.15之间。本实验使用空白基质配制标准工作溶液用于校准曲线，以减少基质效应对测定结果的影响。

2.8 方法学考察

以空白基质提取液配制系列质量浓度的7种目标物混合标准工作溶液，采用本方法进行测定，以所得峰面积为纵坐标(y)，对应质量浓度为横坐标(x，ng/mL)绘制标准曲线。结果表明，7种目标化合物在各自的质量浓度范围内均呈良好线性关系，相关系数(r)均不小于0.999 3。分别以信噪比为3时对应的质量浓度为检出限(LOD)，信噪比为10时对应的质量浓度为定量下限(LOQ)，7种目标化合物的LOD为0.21～0.35 μg/kg，LOQ为0.69～1.16 μg/kg(见表2)。

选择阴性样品进行5.0、10.0、20.0 μg/kg 3个浓度水平的加标回收实验，每个水平做6个平行，7种目标化合物的平均回收率为75.5%～99.0%，相对标准偏差(RSD)为0.78%～5.9%(见表2)。本方法回收率和精密度高，符合蜂蜜中7种兽药残留的监测要求。

表2 7种分析物的线性关系、检出限、定量下限、加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 2 Linear relations,limits of detection,limits of quantitation,recoveries and relative standard deviations of 7 analytes(n=6)

图3 阳性样品的色谱图Fig.3 Chromatogram of a positive sample

2.9 实际样品测定

采用该方法对从市场上随机抽取的28批次蜂蜜样品进行了测定，其中1批次样品检出林可霉素，检出量为5.80 μg/kg，其余27批次蜂蜜样品均未检出。阳性样品的色谱图如图3所示。

3 结 论

针对蜂蜜的基质特点，结合现行有效标准和文献报道，本研究改进传统QuEChERS技术以减少蜂蜜基质的干扰，以1%氨水乙腈为提取溶剂，80 mg ZnO+20 mg PSA为吸附剂，通过优化色谱和质谱条件等，建立了基于QuEChERS前处理技术的同时快速测定蜂蜜中7种林可酰胺类和大环内酯类兽药残留的高效液相色谱-串联质谱法。相比于GB/T 23408-2009[18]和SN/T 1777.2-2007[19]等标准方法，该方法操作步骤少，简单快速、成本低，灵敏可靠，重现性好，同时补充了蜂蜜中林可酰胺类兽药残留的定量检测方法，可为蜂蜜的质量安全监测提供技术支持。