不同生长期蕲春艾叶总黄酮和绿原酸含量变化

曾心怡

长江大学 医学部，湖北 荆州 434023

艾叶系菊科植物艾ArtemisiaargyiLévl.et Vant.的干燥叶，又名灸草，为多年生草本植物，其味辛、苦，性温，入肝、脾、肾经，具有温经止血、散寒止痛之功效，临床用于吐血、衄血、崩漏等症[1]。全国各地所产艾叶中以明代李时珍故居湖北蕲春所产为佳，当地谓之为“蕲艾”，被视为艾中珍品、道地药材[2]。当前，对蕲春艾叶的研究与应用主要围绕其挥发油的提取[3-6]、药理活性[7-9]及临床应用[10-13]研究，鲜有其总黄酮、有机酸、多糖等成分及其综合开发应用研究的报道。蕲春艾叶作为蕲春当地的特色地理标志产品[14]，其开发利用仍集中于挥发性成分，挥发性成分粗加工产品以艾条、艾绒、挥发油等系列产品为主[15]，然而蕲春艾叶的采收期(端午节前后)过后，随着挥发性成分含量急剧下降其药用价值难以持续体现，加之粗加工提取挥发油后药液和药渣含有大量的总黄酮和有机酸成分[16]，大量遗弃势必造成蕲春艾叶资源的浪费，故测定不同生长期蕲春艾叶总黄酮和绿原酸对于开发高附加值产品有积极的促进意义。基于此本研究针对不同生长期蕲春艾叶的总黄酮、绿原酸进行分析和比较，为进一步综合开发和利用提供参考依据。

1 材料

Waters2695型高效液相色谱仪;Agilent ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；CP225D电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；UV-8000紫外-可见分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)；KQ-250E超声波发生器(江苏昆山市超声仪器有限公司)；98-1-B电子调温加热套(天津泰斯特仪器有限公司)。

芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110722-201511，纯度>99.90%)；绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201513，纯度>99.99%)；乙腈(美国天地公司，色谱纯)；其余试剂均为分析纯；水为三蒸水。

艾叶分别于2015年5、6、9、10月采自湖北蕲春(样品编号分别为150515-S1、150518-S2、150616-S3、150630-S4、150916-S5、150927-S6、151001-S7、151007-S8)。样本经湖北中医药大学中药资源开发教研室方念伯教授鉴定为菊科植物艾ArtemisiaargyiLévl.et Vant.的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 不同生长期艾叶药材中总黄酮含量测定

2.1.1溶液配制

2.1.1.1对照品溶液 取芦丁对照品适量，经120 ℃充分干燥，放冷后精密称定，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇置于水浴中微热使溶解，定容并摇匀制成5.0 mg·mL-1的溶液作为芦丁对照品储备液。精密量取芦丁储备液5 mL，置50 mL量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.1.1.2供试品溶液 分别取各批次艾叶药材约1.00 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，密塞称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHZ)30 min，放冷，再称定质量，用60%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置25 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.2线性关系考察 精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min。加氢氧化钠试液10 mL，最后加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，照《中华人民共和国药典》紫外-可见分光光度法，分别于508 nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制工作曲线。得线性回归方程为：Y=0.011 7X-0.007，r=0.999 7。结果表明，芦丁于20.0～100.0 μg·mL-1呈良好的线性关系。

2.1.3方法学考察 精密度试验：精密吸取对照品溶液3.0 mL，置25 mL量瓶中，按2.1.2项下自“加水至6 mL”起操作，在同一条件下分别测定吸光度6次，吸光度的RSD为0.13%，结果表明，仪器的精密度良好。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液2.0 mL，置25 mL量瓶中，按2.1.2项下自“加水至6 mL”起操作，分别在0、10、20、40、60 min后测定吸光度，RSD为0.14%，结果表明，供试品溶液稳定性良好。

重复性试验：取供试品6份，每份1.0 g，精密称定，照2.1.1.2项下的方法依法制备，精密吸取各供试品溶液2.0 mL，分别置25 mL容量瓶中，按2.1.2项下自“加水至6 mL”起操作，在同一条件下分别测定吸光度，将吸光度值代入回归方程中计算总黄酮含量，结果总黄酮含量RSD为1.89%。

2.1.4加样回收率试验 取已知含量的同一批供试品(批号：150515-S1)6份，每份100 mg，精密称定，分别加入一定量的芦丁对照品，照2.1.1.2项下的方法依法制备，精密吸取各供试品溶液2.0 mL，置5个25 mL量瓶中，按2.1.2项下自“加水至6 mL”起操作，依法测定，结果见表1。结果表明，该方法加样回收率良好。

表1 艾叶中芦丁加样回收试率验结果(n=6)

2.1.5测定法 精密吸取供试品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至6 mL，照2.1.2项下的方法，自“加5%亚硝酸钠溶液1 mL”起，依法测定吸光度，同时取供试品溶液1 mL，除不加芦丁对照品溶液外，其余同上操作作为空白，根据标准曲线计算出供试品溶液中含芦丁的质量，即得。

随着肥胖妇女的不断增多，肥胖孕妇的比例也在不断增加，孕前体质量及孕期增重对妊娠结局的影响受到越来越多的关注。有研究[7-8]表明，过高、过低的孕前BMI水平及妊娠体质量增长会导致新生儿体质量异常。所以，孕期应有效控制肥胖孕妇体质量增长。

2.1.6结果 按上述测定方法，对不同生长期蕲春艾叶药材中总黄酮含量进行测定，结果见表2。

表2 不同采收期艾叶总黄酮的含量测定结果 mg·g-1

2.2 不同生长期艾叶药材中绿原酸含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈为(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～13 min，10%～20%A；13～20 min，20%～45%A；20～25 min，45%～10%A)，柱温：30 ℃，检测波长：326 nm，流速：0.8 mL·min-1；进样量10 μL。理论塔板数以绿原酸色谱峰计不低于4000。

2.2.2溶液配制

2.2.2.1对照品溶液 取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.06 mg的溶液，即得。

2.2.2.2供试品溶液 参照文献[16]，取艾叶药材适量、剪碎，精密称取2 g置于具塞锥形瓶中，精密加50%的甲醇溶液50 mL，密塞称定其质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)2 h，取出放冷至室温，用50%甲醇溶液补足减失的质量，滤过，移取滤液10 mL于25 ml容量瓶中，以50%甲醇溶液定容，摇匀，微孔滤膜滤过即得供试品。

2.2.3系统适用性试验 各取上述供试品、对照品和空白溶剂，分别按照2.2.1项下进行分析，结果见图1。由图1可知，该分析条件下绿原酸与相邻的峰分离度良好，且样品中其他组分对绿原酸的分离无干扰。

注：A.艾叶供试品；B.绿原酸对照品；C.空白溶液。图1 绿原酸对照品和艾叶HPLC图

2.2.4线性关系考察 精密吸取对照品溶液2、4、8、10、12、15 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样，测定峰面积。以绿原酸对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程：Y= 27.274X+0.348，r= 0.999 7。结果表明：绿原酸在0.12～0.90 μg进样量与峰面积呈良好的线性关系。

稳定性试验：取供试品溶液(批号：20150515)按上述色谱条件，分别在0、4、8、12、24 h记录其峰面积，峰面积 RSD为0.57%，表明样品在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批供试样品6份，每份约2 g，精密称定，按2.2.2.2项下制备供试品溶液，分别进样10 μL进行测定，计算绿原酸含量，RSD为1.18%，表明重复性良好。

2.2.6加样回收率试验 取已知含量的同一批艾叶6份，每份2 g，精密称定，加入一定量的绿原酸对照品，按2.2.2.2项下制备供试品溶液进行测定，计算加样回收率结果见表3。

表3 艾叶中绿原酸加样回收率试验结果(n=6)

2.3 样品测定结果

取各批次的艾叶药材按2.2.2.2项下供试品溶液的制备依法制备各供试品，按上述测定方法，对不同生长期蕲春艾叶绿原酸含量进行测定，结果见表4。

表4 不同采收期艾叶中绿原酸含量测定结果 mg·g-1

3 讨论

3.1 艾叶药材中总黄酮含量测定

研究中曾参考文献[16]以柚皮苷作为对照品，不加显色剂于283 nm波长处测定吸光度，结果发现，对照品柚皮苷显色后呈淡黄色，而制备的供试品溶液颜色较深，测定存在一定程度的背景干扰，空白试剂无法有效消除样品的背景干扰；而研究发现采用亚硝酸钠显色法能够较好地消除背景干扰，故最终采用亚硝酸钠显色法测定其总黄酮含量。结果表明，5月、6月和9月艾叶中总黄酮含量差异无统计学意义。9月末随着艾叶植株逐渐老化，总黄酮呈现急剧下降趋势，10月后艾叶药材总黄酮质量分数下降至1.36 mg·g-1，含量较9月末前下降了约80%。这一研究结果提示，在艾叶药材的次生代谢产物中，总黄酮对季节的变化敏感度相对较低，仅在10月艾叶植株老化之后，艾叶营养分散，次生代谢产物合成速率减慢，总黄酮含量急剧减少。

3.2 艾叶药材中绿原酸含量测定

研究最初采用文献[16]的梯度洗脱程序对绿原酸含量进行测定，发现洗脱时间较长，长达60 min，不能较好地满足含量测定的时限要求，在此基础上进行优化并缩短梯度洗脱时间，保证绿原酸分离度达到要求，建立的方法更加快捷、迅速。结果表明，5月、6月和9月艾叶中绿原酸含量差异无统计学意义。不同生长期艾叶中绿原酸的含量由高到低依次为：6月、9月、5月、10月。6月艾叶中绿原酸含量较高，10月艾叶绿原酸含量较低，10月份绿原酸含量较9月份前降低了约78%。传统认为艾叶采收期夏季未开花时(端午前后)，此时挥发性成分含量最高，绿原酸的含量也呈现出最高水平。尽管已有大量研究报道指出艾叶熏洗液有较强的抑菌效果，但其抑菌效果是否源自于艾叶挥发性成分和其中的总黄酮、绿原酸类成分的共同作用还值得进一步考证。

4 结论

从不同生长期艾叶总黄酮和绿原酸的分析结果可知：全年中5月、6月和9月时艾叶中总黄酮含量和绿原酸含量总体上变化程度不大，总黄酮和绿原酸对季节变化的敏感程度较低且两者含量变化呈一定程度的正相关，即总黄酮含量降低时绿原酸含量也随之降低。《中华人民共和国药典》中对艾叶的采收期规定为夏季未开花时(端午前后)采收，而此时艾叶的挥发性成分药用价值难以体现，是为艾叶药用资源的浪费。本研究结果为采收期后至10月前这段时期蕲春艾叶的综合利用与合理开发提供参考依据。