13批不同产地红背丝绸总黄酮的工艺优化与含量测定△

钟文，魏江存，陈朝，邱文恺，王成龙，陆梅元，韦丽富

1.广西国际壮医医院，广西 南宁 530201；2.广西中医药大学 第一附属医院，广西 南宁 530023；3.广西壮族自治区食品药品审评查验中心，广西 南宁 530029

红背丝绸别名风叶藤(《广西植物名录》)、野葡萄(《广西药用植物名录》)、毛叶白粉藤(《中华本草》)、左爬藤、葫芦叶、左边藤(《云南药用植物名录》)、安痛藤(《现代中药材鉴别手册》)、苦郎藤(《中国植物志》)[1]。红背丝绸为葡萄科植物毛叶白粉藤Cissusassamica(Laws.)Craib的干燥藤茎及根，具有拔毒消肿、散瘀止痛的功能，有止咳、平喘、解毒的功效，可用于治疗咳嗽、哮喘、毒蛇咬伤、跌打损伤、风湿关节疼痛、痈疮肿毒等，民间多用于治疗跌打损伤、风湿性关节痛、骨折及痈疮肿毒。红背丝绸是广西民间用于治疗毒蛇咬伤的一种常用中草药，对毒蛇咬伤具有良好的治疗效果[2-3]，含有黄酮类、酚酸类、皂苷、有机酸等成分[1，4-5]。相关研究表明[6-15]，黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和降血脂等药理作用。

本实验以红背丝绸的总黄酮含量为测定指标，采用单因素试验考察提取方法、提取体积、提取溶剂浓度、提取时间4个因素对红背丝绸药材总黄酮含量测定的影响，再采用正交试验优选最佳的提取工艺，为进一步研究红背丝绸药材的质量标准提供参考。目前，国内对红背丝绸中总黄酮含量测定的相关报道较少，为保证其药材质量及临床使用效果，本实验建立了红背丝绸总黄酮的含量测定方法，为建立红背丝绸药材的质量标准提供实验依据。植物总黄酮是极具药用价值的天然资源，定量测定红背丝绸总黄酮的含量，并比较不同产地红背丝绸药材总黄酮成分的含量差异，以完善红背丝绸药材的质量标准。 本实验将对13批不同产地的红背丝绸药材进行总黄酮的含量测定，为制定红背丝绸药材的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津UV1780型紫外-可见分光光度计；纯水仪(法国，密理博)；十万分之一天平(XS105D，梅特勒-托利多称重设备系统有限公司)；DFT-1000高速万能打粉机(温岭市林大机械有限公司)。

1.2 试药

芦丁(批号：185126，纯度>98%，上海融禾医药科技有限公司)；其余实验所用试剂均为分析纯。

药材信息见表1，经广西中医药大学药学院陈勇教授鉴定为红背丝绸Cissusassamica(Laws.)Crail，经60 ℃烘干，备用。

表1 红背丝绸样品信息

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取105 ℃干燥恒重的6.24 mg芦丁对照品，置25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解，定容至刻度，摇匀，既得芦丁对照品溶液(0.249 6 mg·mL-1)。

2.2 供试品溶液制备

取药材粗粉1.0 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液30 mL，水浴加热回流提取1.0 h，再称质量，用70%乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，静置过滤，精密量取续滤液1 mL置25 mL量瓶中，即得样品溶液。

2.3 线性方程的制定

分别精密量取2.1项下对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸铝0.4 mL，放置6 min，再加4%的氢氧化钠4 mL，加水至刻度，摇匀，放置10 min，然后在512 nm测定。以吸光度对浓度做线性方程：Y=8.715 7X-0.005 6，r=0.999 2，质量浓度为0.012 48～0.099 84 mg·mL-1与吸光度有良好的线性关系。

3 方法学考察

3.1 精密度试验

精密称取广西富川县采集的红背丝绸粗粉约1.0 g，按2.2项下操作步骤制备供试品，按2.3项下的方法显色测定。在波长512 nm处连续6次测定其吸光度，测定结果RSD为1.26%，故该方法精密度良好。

3.2 稳定性试验

精密称取广西富川县采集的红背丝绸粗粉约1.0 g，按2.2项下操作步骤制备供试品，按2.3项下的方法显色测定，测定同一供试液在不同时间下的吸光度，于512 nm波长处分别在0、20、40、60、80、100、120 min测定吸光度，RSD为2.64%，结果表明，吸收度值在120 min内基本不变。可见样品在120 min内稳定。

3.3 重复性试验

精密称取广西富川县采集的红背丝绸样品6份，每份粗粉约1.0 g，按2.2项下操作步骤制备供试品，按2.3项下的方法显色测定。在波长512 nm处平行测定6份样品的吸光度，计算红背丝绸总黄酮平均质量分数为34.46 mg·g-1，RSD为2.66%，表明该方法重复性良好。

3.4 加样回收率试验

精密称取广西富川县采集的红背丝绸粗粉6份，每份约0.5 g，精密加入芦丁对照品17.2 mg，按2.2项下操作步骤制备供试品，按2.3项下的方法显色测定。在波长512 nm处平行测定样品吸光度，计算药材样品总黄酮的含量。结果平均回收率为98.76%，RSD为2.63%(n=6)，表明该方法回收率良好，见表2。

表2 红背丝绸总黄酮加样回收率试验(n=6)

4 单因素考察

4.1 黄酮最大吸收波长的确定

本次实验显色后对样品溶液和芦丁对照品溶液进行全波长扫描，波长400～600 nm，见图1。在400～600 nm有2个最大吸收波长，分别是510、512 nm。因为样品溶液为混合物，成分复杂而且杂质多，最大吸收波长较芦丁略有偏差，所以测试波长选用512 nm。

注：1.对照品，最大波长为510 nm；2.样品，最大波长为512 nm。图1 芦丁和样品溶液的可见光吸收光谱扫描图

4.2 提取方法考察

精密称取广西富川县采集的药材粗粉约1.0 g，置锥形瓶中，提取时间1.0 h、溶液体积30 mL、70%乙醇为提取条件，分别使用超声提取法、回流提取法和浸渍法提取药材总黄酮，按照2.2项下操作步骤制备供试品，按照2.3项下的方法显色测定，结果表明，回流提取法的总黄酮提取效率最高，故而选择回流提取。见图2。

图2 红背丝绸总黄酮提取方法考察结果

4.3 乙醇溶剂浓度考察

取广西富川县产的药材粉末约1.0 g，精密称定，置锥形瓶中，提取时间1 h、30 mL不同浓度的乙醇溶剂为提取条件，采用回流提取法，以乙醇溶剂不同浓度对药材总黄酮得率做单因素试验，设计乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%，按2.2项下操作步骤制备供试品，按2.3项下的方法显色测定，结果表明，70%乙醇回流提取药材总黄酮的得率最高，见图3。

图3 红背丝绸总黄酮提取乙醇浓度考察结果

4.4 提取时间考察

精密称取广西富川县采集的药材粗粉约1.0 g，置锥形瓶中，以30 mL的70%乙醇为提取条件，选择回流提取法，以提取时间对药材总黄酮得率做单因素试验，设提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，按2.2项下操作步骤制备供试品，按2.3项下的方法显色测定，结果显示提取时间为2.0 h的提取率最高，见图4。

图4 红背丝绸总黄酮提取时间考察结果

4.5 提取体积考察

取药材粉末约1.0 g，精密称定，置锥形瓶中，提取时间1 h、70%乙醇为提取条件，采用回流提取法，以70%乙醇不同体积对药材总黄酮得率做单因素试验，设计70%乙醇提取体积为分别10、20、30、40、50、60 mL，按2.2项下操作步骤制备供试品，按2.3项下的方法显色测定，结果显示提取体积为30 mL的提取率最高，见图5。

图5 红背丝绸总黄酮提取体积考察结果

5 正交试验考察

5.1 正交试验设计

从红背丝绸中提取总黄酮的方法主要是使用有机溶剂提取。根据文献资料，本实验最终使用不同乙醇浓度为溶剂的提取方法，根据单因素考察结果，设置乙醇浓度分别为60%、70%、80%；料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40；提取时间分别为0.5、1.0、1.5 h这3个条件[16-17]。根据分析软件，选用L9(34)正交试验设计，见表3。

表3 红背丝绸总黄酮L9(34)正交因素水平

精密称取红背丝绸药材粉末约1.0 g，精密称定，按2.2项下操作步骤制备供试品，按2.3项下的方法显色测定，再按L9(34)正交设计方案进行试验，使用紫外-可见分光光度计测定红背丝绸总黄酮含量，见表4～5。

5.2 结果分析

5.2.1正交试验

表4 红背丝绸总黄酮L9(34)正交试验结果

表5 红背丝绸总黄酮提取正交试验方差分析结果

5.2.2结果分析 根据分析软件，方差分析结果可知，以总黄酮的含量为实验指标，方差分析证明，乙醇浓度和提取体积差异有统计学意义，而提取时间差异无统计学意义，且各影响因素的强弱为B>A>C，所以对红背丝绸提取效果有统计学意义的因素是乙醇浓度和提取体积，考虑效率和时间，故而选择提取时间为1.0 h，因此最理想的提取方案是A2B2C1，即乙醇浓度是70%，料液比是1∶30，回流提取时间是1.5 h，此提取效果最佳。

6 样品含量测定

精密称取13个不同产地红背丝绸粗粉3份，每份约1.0 g，置锥形瓶中，按照2.2项下操作步骤制备供试品，按照2.3项下的方法显色测定其总黄酮的含量，每个产地测定3份药材总黄酮取平均值。结果见表6。

表6 不同产地红背丝绸药材总黄酮含量测定结果 mg·g-1

7 讨论与总结

本实验以红背丝绸为研究对象，考察乙醇浓度、提取体积和提取时间等影响因素，利用正交试验的方法来优选红背丝绸总黄酮的最佳提取工艺。根据影响因素的选择，采用L9(34)正交试验，进行多次验证实验，结果表明，红背丝绸药材总黄酮的最佳提取工艺：回流提取，乙醇浓度为70%，料液比为1∶30，提取时间为1.5 h，此提取效果最佳，该试验得到的最佳工艺提取条件数据可靠。除此之外，还可以考察提取温度、提取溶剂、溶剂pH和提取次数等。

不同产地红背丝绸药材中总黄酮含量差异较大，广西靖西市的红背丝绸总黄酮含量最高，其次是云南富宁县和广西富川县、广西钟山县、广西贺州市和广西梧州市，而广西合浦县和贵州兴义市产的红背丝绸药材总黄酮含量最低。不同产地红背丝绸总黄酮的含量差异可能是由于不同地域、不同气候、不同土壤以及不同的采摘季节影响而产生的结果。

红背丝绸自然资源丰富，在临床中广泛使用。通过查阅相关文献发现，目前对红背丝绸总黄酮的研究还较少，为保障其临床用药合理、安全、有效，本研究通过正交试验筛选出红背丝绸总黄酮的最佳提取工艺，为进一步研究、开发红背丝绸的药用资源提供参考。