HPLC-ICP-MS联用测定小儿咳喘灵颗粒中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)△

陈荣，张华锋

苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104

铬元素常见价态有0、+2、+3、+6，其中三价铬[Cr(Ⅲ)]毒性较小，为人体所必需，主要生理功能是参与葡萄糖耐量因子的组成，激活某些代谢酶的活性、稳定核酸、促进胆固醇和脂肪酸形成，常用于治疗缺铬导致的糖尿病[1]。但六价铬[Cr(Ⅵ)]毒性较大，具有强氧化性，易穿透生物膜，在1990年就被国际癌症研究机构(IARC)列为致癌物。中成药药材来源复杂，种植、采收、加工各个环节均可能受到外源性元素污染，铬元素作为中药材、中成药重金属检测指标也逐渐受到重视[2-3]，但因为铬元素不同价态毒性差异较大，单以铬总量来规定中药中含量限值并不严谨。目前针对Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的定量研究主要集中在环境、玩具、食品、保健品等领域[4-8]，如何在中成药中定量2种价态铬却鲜有报道。本实验以小儿咳喘灵颗粒为例，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法(HPLC-ICP-MS)探索Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)准确定量方法，为中成药中铬含量限值设定提供参考。

1 材料

Agilent 1260液相色谱仪、Agilent 7900电感耦合等离子体质谱仪(安捷伦公司)；CEM Mars 6微波消解仪(CEM公司)；Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3离心机(赛默飞世尔公司)；Mettler Toledo XS105DU电子天平、Sevenmulti S40 pH计(德国，梅特勒-托利多公司)；HY-5调速多用振荡器(苏州威尔公司)；SK5200HP超声波清洗器(上海科岛公司，53 kHz，200 W)。

硝酸为UP级(苏州晶瑞化学公司，批号：200101007)；氨水为HPLC级(上海阿拉丁生化科技公司,批号：K1820068)；EDTA-2Na(上海凌峰化学试剂公司，批号：20120605，分析纯)；氢氧化钠、碳酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁(国药集团化学试剂公司，分析纯)；水为超纯水(Millipore Synergy超纯水机制得)。

8批小儿咳喘灵颗粒样品均来自四川某厂(批号分别为170904、180402、171107、180102、170606、171106、170802、171102，编号1～8)，以GB 5009.123—2014检测总铬含量异常偏高，见表1。水中Cr(Ⅵ)标准溶液(批号：B1807130，1000 mg·L-1，北京坛墨质检科技有限公司)；九水硝酸铬(Ⅲ)(批号：BCBV5398，纯度99%，美国Sigma公司)。

表1 8批小儿咳喘灵颗粒样品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)测定结果 μg·g-1

2 方法

2.1 色谱条件及仪器参数

Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)；流动相为0.075 mo·L-1硝酸铵溶液[在1 L水中，加入氨水8 mL，混匀后加入硝酸5 mL，用硝酸调节pH至(7.0±0.1)]；流速：1 mL·min-1；进样量为20 μL。

ICP-MS参数：分析同位素52Cr；RF功率为1550 W；采样深度为8 mm；载气为1.2 L·min-1；积分时间为0.8 s，采集模式为He模式，流速4.5 mL·min-1；蠕动泵0.3 r·s-1。

2.2 供试品溶液制备

取样品约0.5 g，精密称定，置50 mL离心管中，加磷酸缓冲溶液(8.71 g磷酸氢二钾和6.80 g磷酸二氢钾用水配制成100 mL磷酸溶液)1 mL，再加氯化镁0.4 g，碱提液(20 g氢氧化钠和30 g碳酸钠用水配制成1000 mL溶液)10 mL，混匀，置摇床上振摇1 h，3500 r·min-1离心(离心半径15.4 cm)10 min，取上清液5 mL(沉淀备用)，精密加入EDTA-2Na溶液[0.1 mol·L-1，用氨水调节pH至(7.0±0.1)]5 mL，混匀，置摇床上振摇1 h，0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液Ⅰ，用于测定Cr(Ⅵ)的含量。

取上述离心后沉淀物，加入硝酸2 mL，反应后用3 mL硝酸转移至消解罐中，微波消解(消解程序：1400 W，120 ℃，爬坡5 min，保持10 min；185 ℃，爬坡10 min，保持25 min)，放冷，置加热板上赶酸至溶液近干，用40 mL EDTA-2Na溶液转移至50 mL量瓶中，用氨水调节pH至(5.0±0.2)，加水定容至50 mL，密塞，置60 ℃水浴中超声30 min，放冷，3500 r·min-1离心(离心半径12.6 cm)10 min，取上清液用0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液Ⅱ，用于测定Cr(Ⅲ)的含量。

2.3 标准溶液制备

取水中Cr(Ⅵ)标准溶液适量，加水配制成每1 mL含5 μg的Cr(Ⅵ)标准溶液储备液；另取九水硝酸铬约0.078 g，置500 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取2 mL，用水稀释至20 mL，即得每1 mL含2 μg的Cr(Ⅲ)标准溶液储备液(临用现配)。量取上述Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)储备液适量，用EDTA-2Na溶液配制成每1 mL含Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)均为0、5、10、20、50、100 μg·L-1的系列混合标准溶液。

3 结果和讨论

3.1 线性关系及检出限考察

将上述系列混合标准溶液依次注入色谱仪，以峰面积(Y)为纵坐标，标准溶液质量浓度(X)为横坐标，进行线性回归，标准曲线方程Cr(Ⅵ)：Y=362.132 6X+127.900 5，r为0.999 7；Cr(Ⅲ)：Y=421.400 4X+18.004 4，r为0.999 9，2种价态在上述质量浓度范围内线性关系良好。混合标准溶液中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)在6 min内完全分离，样品中2种价态色谱法分离度良好，见图1。样品空白溶液连续测定11次，以其信号响应值的标准偏差(δ)的3倍所对应的质量浓度作为检出限，Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)检出限分别为0.01、0.03 μg·L-1。

注：A.混合标准溶液；B.供试品溶液Ⅰ(批号：180102)；C.供试品溶液Ⅱ(批号：180102)；1. Cr(Ⅵ)；2. Cr(Ⅲ)。图1 Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合标准溶液、供试品溶液Ⅰ、供试品溶液Ⅱ色谱图

3.2 重复性和加样回收率

将样品4(批号：180102)按2.2方法平行制备6份，测得Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)含量RSD(n=6)分别为5.3%、2.5%，另平行称取样品9份，以3份为1组，分别精密加入Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)储备液0.75、0.5、0.25 mL，相应回收率Cr(Ⅵ)为90.4%、87.7%、82.1%；Cr(Ⅲ)为95.2%、94.1%、94.6%。

3.3 稳定性考察

将样品4(180102)制备的供试品Ⅰ和Ⅱ，分别于0、2、4、8、12、24、48 h进样，记录Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)峰面积，计算RSD，结果分别为4.6%、2.4%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

3.4 提取方法优化

3.4.1Cr(Ⅵ)提取方式的选择 本实验采用阴离子交换柱，以EDTA-2Na溶液将样品中Cr(Ⅲ)络合成阴离子，从而实现与Cr(Ⅵ)(铬酸根)的分离。通过对样品前处理方法考察，发现使用流动相溶解样品后再用EDTA-2Na溶液超声络合，离心净化后进样，样品中Cr(Ⅵ)未检出，加入高水平Cr(Ⅵ)(5 μg)在同等条件下试验，有相当部分转化为Cr(Ⅲ)，因Cr(Ⅵ)是影响样品毒性的关键，所以Cr(Ⅵ)的准确测定至关重要，该方法不可行，见图2(A)。参照EPA Method 3060A方法，以0.28 mol·L-1Na2CO3和0.5 mol·L-1NaOH混合溶液提取，样品中Cr(Ⅵ)有检出，以样品空白加高水平Cr(Ⅵ)(5 μg)验证，Cr(Ⅵ)的回收率为104.5%，见图2(B)。实验中添加氯化镁是为抑制Cr(Ⅲ)向Cr(Ⅵ)转化，用高水平Cr(Ⅲ)(5 μg)验证，未检出Cr(Ⅵ)，说明0.4 g氯化镁的添加量合适，该方法能有效提取Cr(Ⅵ)，见图2(C)。

注：A. 样品加高水平Cr(Ⅵ)；B. 样品空白加高水平Cr(Ⅵ)；C.高水平Cr(Ⅲ)；1.Cr(Ⅵ)；2. Cr(Ⅲ)。图2 高水平Cr(Ⅵ)转变成Cr(Ⅲ)、高水平Cr(Ⅵ)、高水平Cr(Ⅲ)验证色谱图

3.4.2Cr(Ⅲ)提取方式选择 样品经碱提后，Cr(Ⅲ)以Cr(OH)3形式与Mg(OH)2形成共沉淀，采用硝酸微波消解的方式，使样品中的Cr主要以Cr3+方式存在，再与EDTA-2Na溶液络合。通过比较络合方式(振摇、超声、高温水浴)、时间等因素，发现络合效果60 ℃水浴超声1 h>90 ℃水浴5 min>常温振摇2 h，水浴超声效果比较60 ℃>40 ℃>20 ℃，常温振摇的样品放置时间在24 h后Cr(Ⅲ)检出浓度最高，随时间推移，浓度不再升高。因此本实验选择60 ℃水浴超声来迅速络合Cr(Ⅲ)，由于样品中Cr(Ⅵ)相对Cr(Ⅲ)含量很低，碱提后离心弃去上清，以沉淀物来提取Cr(Ⅲ)，并不会造成Cr(Ⅲ)含量偏差太大。但是采用供试品溶液Ⅰ测定Cr(Ⅵ)时，样品色谱图中出现Cr(Ⅲ)峰，推测可能是因为基质影响导致部分Cr(Ⅲ)未与Mg(OH)2形成共沉淀而被EDTA-2Na络合，该部分Cr(Ⅲ)的量占供试品溶液Ⅱ中Cr(Ⅲ)量的2.4%～5.7%，计算总Cr(Ⅲ)量时将两者合并，见表1。

3.4.3pH的控制 测定铬价态关键在于减少Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的互相转化，pH<4时，Cr(Ⅲ)主要以Cr3+方式存在；pH升高，Cr3+逐渐转变为沉淀，pH为6时基本沉淀完全，随着碱性增强，溶液中出现电负性的[Cr(OH)3]nOH-胶体，当pH升至10以上时，Cr(Ⅲ)溶液易被氧化性物质氧化为Cr(Ⅵ)。在中性溶液体系内，Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)电偶间氧化还原电位很高，价态之间趋于稳定，报道称只有极少数自然系中氧化剂能氧化Cr(Ⅲ)成Cr(Ⅵ)[7]，本实验流动相控制在pH=(7.0±0.1)，是为尽量保证样品中提取出的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)在色谱系统中保持原本价态。在碱性条件下提取Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)多以沉淀形式存在，碱提液经EDTA-2Na络合后，pH在(9.0±0.3)，未进行调整直接进样，基本不会造成Cr(Ⅲ)氧化为Cr(Ⅵ)。本实验色谱柱的pH耐受范围是2.0～10.0，硝酸消解后赶酸至近干，经EDTA-2Na络合后的溶液pH<3，峰形很差，Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)不能分离，用氨水调节至(5.0±0.2)再定容，2种价态完全分离，也利于Cr3+与EDTA-2Na的络合。

3.5 样品测定结果

8批样品均检出Cr(Ⅵ)，检出值为0.027～0.082 μg·g-1，平均值0.051 μg·g-1，Cr(Ⅲ)检出值为5.775～18.743 μg·g-1，平均值10.366 μg·g-1。与国标测定结果总铬量比较，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)总量占其80.8%～94.1%，且各批次间Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、总铬量趋势基本一致。

《中华人民共和国药典》2015年版中明胶铬的限值为不得过百万分之二，USP40 NF35和EuP 9.0中则规定明胶中铬含量不得过10 mg·kg-1，EuP 9.0 5.20.金属催化剂及金属试剂残留量中限定吸入剂的Cr(Ⅵ)的每日允许暴露量(PDE)为不得过10 ng·d-1。本实验4批样品总Cr(Ⅲ)量超过10 mg·kg-1，以小儿咳喘灵颗粒每日最大服用量8 g来计，Cr(Ⅵ)的每日暴露量为216～656 ng，全部超过欧洲药典金属催化剂或试剂残留量中吸入剂Cr(Ⅵ)的限定。因为欧洲药典中该限值规定仅针对吸入剂，小儿咳喘灵颗粒作为中成药中口服制剂毒性还有待考察。

4 结论

本实验参照EPA Method 3060A对小儿咳喘灵颗粒样品进行碱提分离Cr(Ⅵ)，再以微波消解方式释放样品中Cr(Ⅲ)，用HPLC联合ICP-MS同时测定2种铬价态含量。实验中以Cr(Ⅵ)含量的准确测定为重点，优化提取方法，尽量减少Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)间的转化，通过阴离子交换柱达到2种价态完全分离，8批小儿咳喘灵颗粒样品Cr(Ⅵ)含量占本方法测得2个价态总量的0.4%～0.6%。在国标方法测得总铬量超标的情况下，抓住重点对毒性较高的Cr(Ⅵ)含量进行深入研究，相比以总铬量判定因铬元素导致药品毒性更加合理。《中华人民共和国药典》2020年版已对汞、砷作出修订，以适应更广范围样品的价态测定，相信不久将来针对中药材、中成药中有害元素各形态和价态的考察也会更深入和广泛[9-10]。小儿咳喘灵颗粒作为儿科用中成药，更应对检出的重金属元素问题予以重视，科学、客观地评判其安全性，同时结合体内毒性试验进行分析，以期分别制定针对不同价态铬的限量标准。本方法准确度高，重复性好，为更客观、合理地评价中成药中铬的安全性提供参考。