茯苓多糖联合恩诺沙星体内外抗菌活性评价

黄松，崔明旭*，刘爱玲，武晓英，史德胜，王一凡，栗栖凤，李守军，曹贵东

(1.瑞普(天津)生物药业有限公司，天津 300300；2.天津瑞普生物技术股份有限公司，天津 300308；3.太原师范学院生物系，山西晋中 030619；4.山西瑞象生物药业有限公司，太原 030032)

生物膜是指细菌粘附于接触物表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物[1]。生物膜可以增强细菌生存的抗逆性，使其在接受药物治疗时，产生抗药性，导致疾病不易治愈[2]。茯苓多糖是一种阳离子多聚糖，通过碱提醇沉法提取自拟层孔菌科真菌茯苓的干燥菌核。通过物理方法分离得到的茯苓多糖具有良好的生物相容性和无毒性[3]。有文献报导，壳聚糖和抗生素联用，可以增强抗生素对细菌生物膜的清除能力，增强抗生素的杀菌效果[4-5]。目前，尚未有关于茯苓多糖与抗生素联合使用的报告，在本研究中，评价了茯苓多糖联合恩诺沙星对不同细菌体外和体内的抗菌作用。

1 材料与方法

1.1 仪器 HR40-‖ A2型生物安全柜(青岛海尔)；ME204电子天平(上海梅特勒)；ME55电子天平(上海梅特勒)；0.22 μm过滤器(日本岛津)；1 mL一次性注射器(江苏治宇)；G154TW高压蒸汽灭菌锅(厦门致微)；96孔培养板(美国Coming)；生化培养箱(宁波江南仪器厂)；恒温摇床(金坛杰瑞尔)；酶标仪(北京普朗)；移液器(德国Eppendoff)。

1.2 材料与试剂 耐药金黄色葡萄球菌(BSA)分离自白羽肉鸡(Brolier)，由瑞普(天津)生物药业有限公司谢玲玲分离鉴定并保存于瑞普药物研究院；金黄色葡萄球菌ATCC 190807(SA)购自美国菌种保藏中心；大肠杆菌BNCC 336902(E.coli)购自北纳生物公司；茯苓多糖(SJJ)、壳寡糖(COS)和恩诺沙星注射液(ENR)由瑞普(天津)生物药业有限公司生产；4周龄昆明小白鼠36只，购自天津裕达实验动物养殖有限公司；二甲亚砜(DMSO)购自天津博迪；噻唑蓝(MTT)购自上海阿拉丁公司；医用酒精；脱脂棉；其他试剂均为分析纯。

胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)：取30 g，加入到1 L去离子水中，加热煮沸，完全溶解后，分装，121 ℃灭菌30 min，待用。

胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)：取30 g胰蛋白胨大豆肉汤培养基和16 g琼脂，加入1 L去离子水，加热煮沸，完全溶解后，分装，121 ℃灭菌30 min，在生物安全柜中冷却至60 ℃，无菌操作倒入9 cm无菌培养皿中(每个培养皿20 mL)，冷却凝固，待用。培养基均购自北京陆桥公司。

1.3 MIC的测定

1.3.1 细菌的复苏 从-80 ℃冰箱中取出冻存的菌液，37 ℃水浴快速解冻，在TSA平板划线培养，在37 ℃培养24 h后，挑取单菌落一环，接种于50 mL TSB培养基中，在37 ℃恒温摇床中震荡培养8 h，转速为180 r/min，将菌液在4 ℃中保存备用[6]。

1.3.2 二倍稀释法测定MIC 取4 ℃保存的菌液，37 ℃，180 r/min培养6 h后，采用比浊稀释法用TSB将细菌浓度调整到105CFU/mL，备用[7]。

在96孔板中，将药物ENR、SJJ+ENR、COS+ENR、SJJ、COS做二倍稀释，10个梯度，然后加入105CFU/mL的菌液，过夜培养后观察抑菌情况[8-9]。

1.4 生物膜试验

1.4.1 生物膜的培养 在96孔板的每个孔内加入200 μL稀释至108CFU/mL的菌液，四周加无菌PBS，静置在37 ℃恒温培养箱内，培养72 h，让细菌形成生物膜[10]。

1.4.2 药敏试验 形成生物膜后，弃掉培养基，用0.9%的NaCl溶液清洗1次，洗去浮游菌，再加入一定浓度的药物(ENR为16，32，64，128 μg/mL；CHI为512 μg/mL和256 μg/mL)和TSB培养基，分为单独用药和联合用药两种，在恒温箱中孵育24 h[1]。

1.4.3 MTT试验 药物处理后，弃掉培养基，用0.9%的NaCl溶液清洗3次，加入10 μL 5 mg/mL的MTT溶液和90 μL的TSB培养基，37 ℃静置孵育3 h后，然后弃掉培养基，加入100 μL DMSO溶解蓝紫色结晶甲瓒，用酶标仪在570 nm处测定吸光值，吸光值同活菌数量成正比[1]。

1.5 体内抑菌试验

1.5.1 试验动物及饲养 清洁级健康昆明小白鼠(20±2)g，4周龄，共36只，同等条件下饲喂，昼夜节律，供给充足的饮水和饲料[10]。

1.5.2 攻毒菌液的制备 取对数期金黄色葡萄球菌(SA)，调整菌液浓度至108CFU/mL，9000 r/min离心10 min，弃去上清培养基，用无菌PBS重悬细菌，调整菌液浓度至5×105CFU/mL，4 ℃静置待用[11]。

1.5.3 小鼠急性感染模型 将试验小鼠随机分为6组，每组6只，每只小鼠腹腔注射100 μL金黄色葡萄球菌(5×105CFU/mL，无菌PBS稀释)，24 h后腹腔注射给药，空白组注射100 μL生理盐水，对照组1注射100 μL ENR，对照组2注射100 μL SJJ，对照组3注射100 μL COS，实验组1注射100 μL SJJ+ENR，实验组2注射100 μL COS+ENR，每天一次，连续给药2 d[12]。

1.5.4 小鼠体内细菌载量的测定 最后一次给药12 h后，断颈处死小鼠，无菌取肝脏、肾脏和肺脏，称取0.1 g，加入1 mL无菌PBS匀浆，稀释适当倍数，取50 μL均匀涂布于TSA平板，37 ℃培养过夜，计数CFU[10]。

1.6 数据采集和分析 所有数据的分析和显著性差异P值的计算均采用GraphPad Prism V6.01 数据分析软件进行，用平均值±标准偏差(means±SD)表示，P值小于0.05为显著性差异，P值大于0.05为无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 MIC的测定 如表1所示，SJJ在两种浓度下，没有使ENR在体外抑制BSA的MIC降低。

表1 各种药物对BSA的MICTab 1 MIC of BSA for various medicines

如表2所示，SJJ在两种浓度下，没有使ENR在体外抑制SA的MIC降低。

表2 各种药物对SA的MICTab 2 MIC of SA for various medicines

如表3所示，SJJ在两种浓度下，没有使ENR在体外抑制E.coli的MIC降低。

表3 各种药物对E.coli的MICTab 3 MIC of E.coli for various medicines

综上，SJJ联合ENR在体外抑制浮游菌的试验表明，其没有明显的改善ENR的抑菌能力，不能使ENR的MIC降低。

2.2 生物膜试验 在抑制BSA生物膜试验中，结果如图1所示，低浓度的ENR无明显的抑制BSA生物膜的效果，而联合SJJ后，表现出明显的对BSA生物膜的抑制效果；在图2中，COS与ENR联合使用抑制BSA生物膜，无明显的增效作用。

图1 SJJ联合ENR抑制BSA生物膜Fig 1 SJJ combined with ENR inhibits BSA biofilms

图2 COS联合ENR抑制BSA生物膜Fig 2 COS combined with ENR inhibits BSA biofilms

在抑制SA生物膜试验中，结果如图3所示，低浓度的ENR联合SJJ后，抑制SA生物膜的效果无显著性增加，高浓度的ENR联合SJJ后，抑制SA生物膜的效果有显著性增加；在图4中，COS与ENR联合使用抑制SA生物膜，无明显的增效作用。

图3 SJJ联合ENR抑制SA生物膜Fig 3 SJJ combined with ENR inhibits SA biofilms

图4 COS联合ENR抑制SA生物膜Fig 4 COS combined with ENR inhibits SA biofilms

2.3 脏器载菌量的检测 在体内抑菌试验中，肝脏活菌计数结果如图5所示，SJJ+ENR用药后，肝脏的活菌数量明显少于单独使用ENR给药组，表明SJJ可以显著增加ENR在体内抑制SA的效果，如图6和图7所示，这一结果在肾脏和肺脏中也得到了验证。

图5 药物处理后的肝脏活菌计数Fig 5 Viable count of liver bacteria after drug treatment

图7 药物处理后的肺脏活菌计数Fig 7 Viable count of lungs bacteria after drug treatment

3 讨论与结论

试验结果显示，在抑制浮游菌的实验中，SJJ和COS联合ENR没有明显增强抑菌效果，其最小抑菌浓度仍保持不变；在抑制细菌生物膜的试验中，SJJ联合ENR在抑制BSA和SA生物膜的活性方面，有较好的效果，COS联合ENR在抑制BSA生物膜方面，没有明显的增强ENR的抑菌活性，在抑制SA生物膜方面，COS减弱了ENR的生物活性；在体内试验中，SJJ联合ENR在治疗小鼠肝脏和肾脏的细菌感染时，SJJ使ENR的抑菌效果显著性增强，而COS处理的小鼠ENR抑菌活性没有显著性增强；在治疗肺部感染方面，SJJ和COS均可以使ENR的抑菌效果显著性提高，但是SJJ要略优于COS。

吴俊伟[7]研究表明，恩诺沙星的抗菌谱广，能作为广谱抗菌药使用，但是其抑菌能力偏弱。其设计的恩诺沙与硫酸粘菌素联合药敏试验结果显示，硫酸粘菌素对恩诺沙星抑制大肠杆菌、沙门氏菌有显著的增效作用，对金黄色葡萄球菌的增效作用略有降低，这可能和硫酸粘菌素作用于细胞膜机理相关；马燕[13]在研究壳聚糖与磺胺类抗生素联合用药抑制绿脓杆菌的试验中发现，壳聚糖可以作为增强剂和抗生素联用，起到强效抗菌的目的。本试验中，采用水提醇沉得到的茯苓多糖联合恩诺沙星进行体外和体内的药敏试验，在体外的浮游菌实验中，茯苓多糖没有明显增强抗生素抑菌能力的作用，但是在生物膜和小鼠体内实验中，可以从试验结果看到明显的增效，这和母海钵[14]在研究壳聚糖联合庆大霉素抑制细菌生物被膜的实验结果相吻合，表明阳离子多聚糖可以在富含大量阴离子的细菌生物被膜表面聚集，并破坏生物被膜的结构，增大其通透性，促进抗生素透过生物被膜，从而增强其抑制生物被膜的能力。本试验所使用的茯苓多糖，也会富含大量阳离子的多聚糖，在联合药敏试验中，表现出了更好的抑菌增效作用，为茯苓多糖产品开发提供了思路。

本文的研究发现，相比单独的恩诺沙星，茯苓多糖(SJJ)和恩诺沙星联用能更有效地破坏金黄色葡萄球菌的生物膜。根据文献报导，阳离子多糖可以促进抗生素透过细菌的生物膜，从而破坏生物膜，抑制致病菌[15-16]。而茯苓多糖(SJJ)作为一种多阳离子多聚糖，正好利用这一策略，提高了抗生素的作用效果，减少了所需抗生素的剂量，有助于减少由于抗生素滥用导致的耐药菌增多这一现象。同时，茯苓多糖和恩诺沙星联用，在抑制分离自白羽肉鸡的金黄色葡萄球菌(BSA)方面，也有很明显的抗菌效果，这也为后续开发针对耐药性致病菌提供了实验依据。