高效液相色谱法测定四环素片中四环素含量

刘素梅，方忠意，王丽，张跃京，臧合英，李慧素

(河南省兽药饲料监察所，郑州 450002)

四环素类抗生素是20 世纪40年代发现的一类具有菲烷(母核)的广谱抗生素，该类抗生素广泛应用于革兰阳性和阴性细菌、支原体和立克次氏体等引起的感染[1]。四环素片收载在《兽药质量标准》(2017年版)化学药品卷中，含量测定采用微生物检定法，该方法操作较繁琐，试验周期长，影响因素多，结果重复性差，拟采用简便高效的高效液相色谱法，对四环素含量进行测定。

1 材 料

1.1 仪器设备 Waters高效液相色谱系统：包括2695分离系统、2489紫外检测器、Empower2色谱工作站；METTLER XS205电子天平；MILIPORE超纯水处理器等。

1.2 试药试剂 盐酸四环素对照品购自中国食品药品检定研究院，液相用甲醇、乙腈为色谱纯试剂，磷酸二氢钾为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 标准工作液的制备 精密称取盐酸四环素对照品50 mg，置50 mL量瓶中，加0.01 mol/L盐酸溶液适量，振摇使溶解，加0.01 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；临用前用0.01 mol/L盐酸溶液稀释成浓度为10、20、50、100、200和500 μg/ml的标准工作液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(相当于四环素0.05 g)，置100 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液10 mL，振摇使溶解，加0.01 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；精密量取上清液5 mL，置25 mL量瓶中，加0.01 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。

2.1.3 提取方法的考察 四环素在水中微溶，与盐酸结合生成盐酸四环素后溶于水[1-2]，所以先用0.1 mol/L盐酸溶液溶解，再用0.01 mol/L盐酸溶液进行稀释[3-4]，分别考察了直接稀释、超声提取10 min和超声提取20 min的提取效果。四环素用0.1 mol/L盐酸溶液溶解效果优于0.01 mol/L盐酸溶液溶解；振摇溶解提取效果优于超声提取效果，原因可能是四环素不稳定，在超声过程中降解的原因。所以采用0.1 mol/L盐酸溶液10 mL振摇溶解，再用0.01 mol/L盐酸溶液稀释的提取方法。

2.2 色谱条件的选择 查阅相关文献，先后考察了0.1 mol/L磷酸氢二铵-乙腈[5]、0.01 mol/L十二烷基硫酸钠溶液-乙腈[6]、0.1 mol/L草酸铵-二甲基甲酰胺-0.2 mol/L磷酸氢二铵[7-8]、甲醇-0.05 %庚烷磺酸钠溶液-三乙胺[9]、乙腈-水-甲酸[10]等系统，结果四环素与其他杂质分离度不好，并且四环素峰前延；后采用《中国药典》2015年版二部盐酸四环素含量测定所用流动相[2]：醋酸铵溶液[0.15 mol/L醋酸铵溶液-0.01 mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺(100∶10∶1)，用醋酸调节pH值至8.5]-乙腈(83∶17)，四环素峰前延，对称因子为0.8065，并且基线噪音大。后采用0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH值至2.0)-甲醇(88∶12)，四环素峰形、柱效及分离度均满意，所以采用该系统作为流动相。

《中国药典》2015年版二部盐酸四环素含量测定项下检测波长为280 nm，所以本研究也采用280 nm作为检测波长，最终色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH值至2.0)(12∶88)为流动相；柱温为40℃；检测波长为280 nm。

2.3 线性与范围 按2.1.1项下方法制备系列浓度标准工作溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度与相应的组分峰面积算回归方程和相关系数，回归方程为：y=1803x+4150，相关系数r=0.99999，即在10～500 μg/ml范围内，四环素具有良好的线性，结果见图1。

图1 四环素标准曲线图Fig 1 Standard curve of Tetracycline

2.4 准确度 取空白辅料0.02 g，共取6份，精密称定，分别加入四环素原料50 mg，混匀。按照2.4.1.2项下供试品制备方法进行处理，注入液相色谱仪，记录色谱图。以加入的同批四环素原料为对照，同法测定，按外标法以峰面积计算，结果见表1。结果表明，该试验回收率高，准确度好，可以准确测定四环素含量。

表1 回收率试验结果(n=6)Tab 1 Results of recovery tests(n=6)

2.5 精密度 取四环素片样品20片，精密称定，研细，精密称取细粉0.07 g，共6份，按2.4.1.2项下供试品制备方法进行处理，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，结果乘以0.9242，即得含量，计算RSD，结果见表2。结果表明，该试验重复性良好。

表2 精密度试验结果(n=6)Tab 2 Results of precision tests(n=6)

2.6 专属性 经过考察，四环素片在生产过程中使用辅料为淀粉和硬脂酸镁，我们模拟生产工艺，配制了含0.2 %硬脂酸镁的淀粉进行压片，作为空白样品。称取研细后的空白样品0.02 g，按2.4.1.2项下供试品制备方法进行处理，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，空白无干扰，见图2～图5。

图2 四环素对照品(100 μg/mL)色谱图Fig 2 Chromatogram of Tetracycline reference substance (100 μg/mL)

图3 四环素片样品色谱图Fig 3 Chromatogram of Tetracycline Tablets

图4 空白样品阳性添加色谱图Fig 4 Chromatogram of positive control sample

图5 空白样品色谱图Fig 5 Chromatogram of negative sanple

2.7 溶液稳定性 取精密度项下的一个样品，分别在0，1，2，6，10和12 h进样，考察样品稳定性，结果显示，样品在12 h内稳定。

2.8 耐用性 取四环素对照品溶液，在不同柱温、不同pH值下进行测定，以及采用不同的色谱柱，对该方法的耐用性进行考察。

2.8.1 不同柱温的考察 考察了30 ℃、40 ℃和50 ℃等温度下，对四环素的影响。从结果看，不同柱温下，四环素峰形及柱效均达到满意效果，但随着温度的降低，色谱峰展宽严重，所以柱温定为40 ℃。

2.8.2 不同pH值的考察 流动相中0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值对色谱峰影响很大，考察了2.0、2.5和3.0三个不同pH值下的四环素色谱峰，分别称取4-差向四环素对照品、盐酸四环素对照品和土霉素对照品，配制成每1 mL含各组分均为0.1 mg/mL的混合对照品溶液进样。pH值2.5和3.0时峰形对称性变差，且四环素与土霉素的分离度降低。考虑到柱子的耐用性，流动相pH值不能过低，所以采用2.0。

2.8.3 不同柱子的考察 分别考察了Waters Xbridge C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)、phenomenex Gemini C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)和Agela Venusil MP C18(3 μm，4.6 mm×150 mm)四种色谱柱，取2.8.2项下混合对照品溶液进样。四种色谱柱在柱效和分离度上都能满足检测需求。

2.9 样品测定 按2.1.2项下供试品溶液制备方法进行处理，进高效液相色谱仪分析，按外标法以峰面积计算四环素的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果Tab 3 Results of contents determination of samples

3 讨 论

3.1 现行四环素片质量标准中含量测定采用的微生物检定法 该方法操作繁琐，试验周期长，影响因素多，结果重复性差，经验证，本试验建立的高效液相色谱法方法简单、专属强、准确度高、重现性好，适用于四环素片的含量测定。

3.2 目前中国食品药品检定研究院提供的只有盐酸四环素对照品 无四环素对照品。四环素分子式为C22H24N2O8，分子量为444.43，盐酸四环素分子式为C22H25ClN2O8，分子量为480.9，所以用盐酸四环素对照品测定四环素含量，计算结果需乘以系数0.9242。

3.3 四环素和盐酸四环素的溶解性不同 所以进行准确性验证时，采用四环素原料做添加回收试验，经验证，回收率为100.03%。

3.4 试验所用的四环素片含量偏低 原因可能是该样品质量问题，也可能是按照现行质量标准测定含量合格，按照本方法测定含量不合格。