阿维菌素类药物残留检测衍生化研究

张玉洁，沈昕，李丹，李倩，王鹤佳

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

阿维菌素类药物化学结构新颖，作用机制独特，杀虫活性强，杀虫谱广，因而被广泛应用于牛、羊等动物。2020年4月1日生效的GB 31650-2019规定，阿维菌素禁用于泌乳期牛、羊，在牛羊组织中的最大残留限量(MRL)为20～100 μg/kg；伊维菌素在牛奶中的最高残留限量为10 μg/kg，在牛、羊、猪组织中的MRL为30～100 μg/kg；多拉菌素在牛奶中的MRL为15 μg/kg，在牛、羊、猪组织中的MRL为5～150 μg/kg；乙酰氨基阿维菌素在牛奶中的MRL为20 μg/kg，牛肌肉等组织中MRL为100～2000 μg/kg[1]。对比之前的农业部第235号公告，GB31650对阿维菌素类药物最主要的变化一是取消了多拉菌素泌乳期的禁用限制，制定了其在牛奶中的MRL，二是增补了乙酰氨基阿维菌素的限量规定[2]。阿维菌素类药物是目前兽医临床上用量最大的抗寄生虫药物，而其在奶、奶粉及动物组织中的残留也会对消费者健康产生不利影响。

目前阿维菌素类药物主要采用高效液相色谱法[3～16]和液相色谱-质谱法[8]进行分析。虽然阿维菌素分子结构中具有共轭二烯结构， 能在245 nm处有强的紫外吸收，但紫外检测法的选择性和灵敏度不能满足要求。80年代后，荧光衍生化检测成为阿维菌素残留检测的主要研究方向。经过de Montigny等人[4]的研究摸索和逐步改善，基本确定了N-甲基咪唑和三氟乙酸酐作为衍生化试剂，乙腈作为反应溶剂。发展至目前，各具体方法的衍生化步骤存在差异，不同方法的检测限、定量限也有很大差别。

与液相色谱-质谱法相比，高效液相色谱法具有仪器普及率高、成本低、操作简单、基质影响小，定量准确等特点。而相比于其他的禁用药物，阿维菌素类药物衍生化后的荧光响应值很高，杂质干扰很少，很适合用高效液相色谱法进行定量检测。因此，本研究在对比现行标准衍生化方法的基础上，详细研究了时间、温度及光照条件对衍生化产物的影响，从而制定了衍生化程度最充分、用时最短、操作最简便的衍生化方法，并且将这一衍生化方法应用于牛奶、羊奶、奶粉及猪、牛的肌肉、肝脏等组织的检测，实践效果良好。

1 材料与方法

1.1 仪器设备、试剂及对照品 Agilent 1100高效液相色谱仪(配荧光检测器)；SPE柱：Bond Elut C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)；固相萃取装置；氮吹仪；高速冷冻离心机；Milli-Q超纯水仪等。

阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素对照品，纯度≥91.0%，由中国兽医药品监察所提供。甲醇、乙腈、无水乙醇为色谱纯，异辛烷、三乙胺为分析纯。试验用水为符合国家标准的一级水。

1.2 溶液配制 衍生化试剂A液：N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)。现用现配。B液：三氟乙酸酐-乙腈(1+2，v/v)。现用现配。

1.3 试验方法

1.3.1 液相色谱条件：色谱柱： C18250 mm × 4.6 mm (i.d.)，粒径5 μm； 流动相∶乙腈：水(90∶10,V/V)；流速: 1.8 mL/min；检测波长：激发波长365 nm；发射波长475 nm；柱温：40 ℃；进样量: 40 μL。

1.3.2 衍生化步骤 洗脱液氮气吹干后，向试管中依次加入衍生化试剂A液100 μL和B液150 μL，密闭，涡动10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 μL，涡动10 s。衍生化反应后加650 μL甲醇混匀。经0.45 μm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱检测。

1.3.3 测定温度对衍生化产物的影响 取100 ng/mL的阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素混合标准工作液1 mL至玻璃试管中，50 ℃氮气吹干后按照1.3.2步骤加入衍生化试剂和催化反应液。制备三组样品，常温组14个样品，另外两组各12个样品。上述样品分别置于常温、50 ℃和65 ℃恒温箱中避光反应。并分别于0、15、30、45、60、75及100 min时间点从各组取出两个平行样品加入甲醇后上机测定。

1.3.4 测定光照对衍生化产物的影响 取100 ng/mL的阿维菌素类药物混合标准工作液1 mL至玻璃试管中，50 ℃氮气吹干后按照1.3.2步骤加入衍生化试剂和催化反应液。设置两组样品，每组2个平行样，一组用棕色试管置于黑暗密闭条件下反应，另一组用透明试管置于实验室明亮光照条件下反应。两组均在常温下反应75 min，加入甲醇后上机测定。

1.3.5 组织样品衍生化测定步骤 奶及奶粉的样品前处理过程见张玉洁等的试验方法[5]。与之相比，猪、牛肌肉、肝脏的前处理过程略有差异：称取试料(5±0.05) g， 8 mL乙腈作为提取溶剂提取两次，同时，离心管中加入不锈钢珠2粒防止组织凝聚抱团，之后的净化浓缩步骤同奶及奶粉中[5]的相关步骤。

洗脱液氮气吹干后，按照1.3.2步骤加入衍生化试剂和催化反应液，65℃密闭避光反应15 min，取出后加650 μL甲醇混匀。经0.45 μm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱检测。

2 结果与分析

2.1 衍生化条件的温度-时间曲线 根据平行样品的峰面积平均值及对应温度和时间点绘制了反应曲线图(图1)如下。

图1 温度和反应时间对阿维菌素类药物衍生化效果的影响Fig 1 The derivatization effect of the avermectins under various temperature and duration time

2.2 光照对衍生化反应的影响 在实验室明亮光照和避光两种条件下的色谱图如下(图2)，结果显示明亮光照下四种药物的峰面积均明显低于避光条件下的衍生化产物峰面积。

注：红色为避光条件下4种阿维菌素类药物衍生化反应的色谱图，蓝色为实验室明亮光照下4种阿维菌素类药物的色谱图。图2 光照对衍生化反应的影响Fig 2 The effect of light on the derivatization

2.3 奶、奶粉及猪、牛组织样品的测定 牛奶、羊奶、奶粉及猪、牛的肌肉和肝脏样品经衍生化后用荧光检测器进行测定，以信噪比(S/N)≥10，且在该添加水平的回收率和变异系数均满足残留分析要求的最小浓度作为定量限(LOQ)。经测定乙酰氨基阿维菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在牛奶、羊奶组织中的定量限为0.5 μg/kg；在猪、牛的肌肉、肝脏及奶粉中的定量限为5 μg/kg。羊奶空白样品、标准溶液及0.5 μg/kg添加样品衍生化色谱图如下(图3A、B、C)：

3 讨论与结论

3.1 阿维菌素类药物衍生化测定现状 对阿维菌素类药物的衍生化试剂普遍使用N-甲基咪唑-乙腈和三氟乙酸酐-乙腈进行[3～15]，不过不同方法间衍生化反应条件有所差异，反应温度、时间跨度较大。现有国家标准GB 29696-2013[6]和程林丽等[7]的研究均以牛奶为基质，其衍生化反应在室温进行，时长30 min。农业农村部公告1025号—5—2008《动物性食品中阿维菌素类药物残留检测——酶联免疫吸附法，高效液相色谱法和液相色谱—串联质谱法》测定了牛肝脏、肌肉和猪肝脏中的4种阿维菌素类药物，其衍生化反应在96 ℃下反应100 min[8]。农业部公告781号—5—2006《动物源食品中阿维菌素类药物残留量的测定 高效液相色谱法》[9]和王海等人[10]测定了动物组织中阿维菌素、伊维菌素和多拉菌素三个药物，其衍生化反应在室温瞬间进行。魏广智等[11]认为阿维菌素类药物在室温下衍生化反应15 min达到峰值，反应时间太短或过长都影响产率。谢显传等人[12]研究了阿维菌素的荧光反应影响因素，认为温度对其衍生化反应影响不大，衍生化反应对光线敏感，反应在30 min左右达到峰值。Ali等人[13]曾研究了5种阿维菌素类药物的荧光衍生化反应条件和动态，结果显示阿维菌素、伊维菌素和莫西克丁的反应产率瞬间可达峰值，此后逐渐降低。而乙酰氨基阿维菌素在室温下要7 h才能达到峰值，若在65℃下反应90 min产率最高。

注：1-乙酰氨基阿维菌素，2-阿维菌素，3-多拉菌素，4-伊维菌素图3 羊奶样品色谱图Fig 3 The chromataograms of goat's milk

由此可见，目前阿维菌素类药物的衍生化方法各异。经本试初步验摸索，猪、牛组织、牛羊奶和奶粉的提取液经过C18固相萃取柱净化浓缩后，在室温下衍生化反应15或30 min并不充分，将进样溶液立即进样与存放数小时后再进样所得的乙酰氨基阿维菌素色谱峰面积相差较大，说明在放置过程中试样溶液中的残留药物和衍生化试剂仍在继续进行衍生化反应。此现象用Ali等人[13]的研究结果可以应证。

3.2 反应温度、时间及光照对衍生化产物的影响从本实验对衍生化反应温度及时间的研究结果可以看出：反应若在室温下进行，阿维菌素、多拉菌素及伊维菌素经过15-30 min，衍生化反应基本可以完成，而乙酰氨基阿维菌素则需75 min以上反应才能进行完全。衍生化反应若在加热条件下进行，65℃反应15 min，四种药物的衍生化即可充分完成。这其中，阿维菌素的反应规律又与其他三种药物略有差别：65℃下反应超过70min，其产物含量不升反降。综合四种药物的温度-时间反应曲线来看，室温反应75 min或者65℃反应15 min都可以获得较好的衍生化效果。

而本实验结果显示在实验室明亮光照和避光两种条件下，前者四种药物的峰面积均明显低于后者。由此可见，在反应温度和时间一定的前提下，光照对衍生化产物的稳定性影响很大，应尽量避光反应。

综合考虑4种药物的反应效率以及试验时长的问题，本实验确定衍生化反应条件为65℃避光反应15 min。此反应条件下的衍生化反应效率高、反应充分，并且反应后的衍生产物加入甲醇后形成的醇式衍生物含量稳定，反应结束后立即进样与存放24 h后再进样所得的检测组分的峰面积相差无几。

3.3 奶、奶粉及猪、牛组织的检测 经过衍生化条件的优化，4种阿维菌素类药物在牛奶和羊奶中的定量限可降低至0.5 μg/kg，在猪、牛组织及奶粉中的定量限可达到5 μg/kg。与现有国家标准GB 29696-2013[6]、GB/T 22968-2008[8]和其他的液相色谱法[7、9～11]的研究相比，应用该衍生化方法后，四种阿维菌素类药物的定量限更低，更能符合检测需求。