清香酒醅中高产细菌素乳酸菌的筛选及其细菌素特性研究

王萌萌,史 瑛,李智琪,毛 健,张秀红

(1.山西师范大学生命科学学院,山西临汾 041004;2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;3.山西师范大学食品科学学院,山西临汾 041004)

中国白酒的工艺特点是制曲酿酒。大曲的制备采用生料制曲、自然接种、开放培养的生产方式,整个酿酒过程处于开放环境中,白酒酿造涉及到的微生物非常复杂,主要包括酵母菌、细菌、霉菌、放线菌等[1-2]。清香型白酒主要采用地缸发酵的方式生产,厌氧环境下存活的微生物主要包括酵母菌和乳酸菌。乳酸菌通过发酵代谢产生乳酸,进而与乙醇酯化产生白酒香气成分乳酸乙酯,促进酒体的形成,尤其在清香白酒中,主体香气成分就是乙酸乙酯和乳酸乙酯,因此乳酸菌在清香白酒酿造中具有重要作用。但是在每年春末夏初,随着气温的升高,酿酒环境中的乳酸菌开始大量繁殖,导致酒醅中乳酸菌大幅增加,使一部分高粱淀粉降解的还原糖转化为乳酸,从而降低产酒量。同时乳酸过量会产生大量乳酸乙酯,而改变酒体香气成分比例,降低基酒质量[3-4]。目前各个酒企普遍缺乏夏季有效控制乳酸菌数量的手段和方法,因此在夏季来临前选择停产。事实上在停产前,基酒的产量和质量也会受到一定的影响。

乳酸菌是白酒酿造中重要的功能微生物,而乳酸菌在酿酒环境中的数量是控制基酒品质和质量的重要条件。细菌素是乳酸菌产生的一类竞争性抑制亲缘关系较近的天然蛋白质或肽类物质[5],且在食品领域有广泛的应用[6]。Mora等[7]在研究中发现乳酸菌产生的细菌素能够有效促进近缘菌株自溶。因此可以用作控制乳酸菌数量的方法和策略。目前关于酒醅乳酸菌细菌素的研究尚未见报道。本研究从清香型白酒酒醅中筛选出产细菌素的乳酸菌,分析其细菌素特性以及对酿酒微生物的影响,为夏季酒醅控酸开辟新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清香型酒醅 山西省杏花村汾酒厂股份有限公司提供;酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)J2-1、J7-2、J10-1、J12-1、Q4-5、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientails)Q3-1 分离自汾酒大曲及酒醅,保存于山西师范大学汾酒酿造过程研究中心;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 由山西师范大学汾酒酿造过程研究中心提供;胰蛋白酶(≥2500 U/mg)、木瓜蛋白酶(≥2000 U/mg) 阿拉丁试剂公司;蛋白酶K(≥40 U/mg)、胃蛋白酶(≥2500 U/mg) 上海生工;其余药品 均为国产分析纯。

Thermo 905/490 L-80 ℃超低温冰箱 赛默飞世而科技(中国)有限公司;DYY-6C型电泳仪 六一仪器厂;Gel Doc XR+凝胶成像仪 Bio-RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 清香酒醅中乳酸菌的分离 无菌条件下将清香酒醅稀释至10-5、10-6、10-7后,分别取200 μL稀释液于MRS固体培养基中。将符合乳酸菌形态的单菌落进行革兰氏染色和触酶试验[8-9]。

1.2.2 产细菌素乳酸菌的初筛 将分离纯化后的乳酸菌菌株在MRS液体培养24 h后,离心(12000 g、10 min)过滤,得到无细胞发酵上清液[10-12]。以金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)为指示菌,以杨尚娇等[13]的方法筛选产细菌素乳酸菌。

1.2.3 乳酸菌产细菌素的特性

1.2.3.1 酸性物质和过氧化氢试验 将液体培养基的pH分别用1.0 mol/L乳酸、乙酸进行调节,使其与菌株发酵上清液的pH相同[14-15]。同时,调节发酵上清液的pH至7.0,保持过氧化氢酶浓度在1.0 mg/mL,37 ℃温浴2 h后,调回初始值[16-17]。S.aureus为指示菌,以杨尚娇等[13]方法检测抑菌物质。

1.2.3.2 蛋白酶敏感性试验 使用木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶检测蛋白酶敏感性,S.aureus为指示菌,参照1.2.3.1的方法检蛋白酶敏感性[15-17]。

1.2.4 产细菌素乳酸菌的鉴定 用CTAB法[18]提取乳酸菌DNA作为模板,细菌通用引物1492R和27F PCR扩增16S rDNA片段,送生工(上海)公司进行测序。测序结果通过MEGA 6.0进行统计和聚类分析,构建进化树。

1.2.5 乳酸菌的生长及其细菌素的抑菌活性 将乳酸菌按3%接种量接种于液体培养基中,每隔2 h测OD600值。同时,每4 h制备一次发酵上清液,S.aureus为指示菌,检测抑菌直径[19]。具体方法参照1.2.2。

1.2.6 乳酸菌细菌素理化性质探究 将乳酸菌细菌素应用的首要条件是,乳酸菌细菌素能够在酿酒环境中保持活性,因此需要进一步探究乳酸菌细菌素的稳定性。

1.2.6.1 乳酸菌细菌素稳定性探究 取4、30、60、90、121 ℃探究乳酸菌细菌素温度耐受性;将发酵上清液的pH调整至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0,测定乳酸菌细菌素pH耐受性[20-22]。S.aureus为指示菌,参照杨尚娇等[13]方法检测。

1.2.6.2 乳酸菌细菌素对酿酒微生物的影响 选取酒醅中微生物酵母菌为指示菌,检测乳酸菌细菌素对酒醅中主要酿酒微生物的影响,参照杨尚娇等[13]方法检测。

1.3 数据处理

上述实验结果均重复三次,采用Graphd 6.0、SPSS 24.0等对实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离及筛选

将清香酒醅来源的菌悬液涂布在MRS固体培养基培养并进行划线分离,菌株YP36在37 ℃下培养48 h后,生长状况如图1所示:YP36菌落呈圆形、表面凸起、湿润、边缘整齐,形态为杆状,无鞭毛,符合乳酸菌形态特征。

图1 菌株YP36菌落及菌体形态Fig.1 Colony and morphology of strain YP36注:A:乳酸菌菌落形态;B:10×100显微镜形态示意图。

直径为0.8～2.0 mm、白色或微白色、具有光泽的圆形单菌落,且革兰氏染色阳性,触酶阴性的菌株初步认为乳酸菌。共筛选出符合乳酸菌形态及生理特征的菌株146株。

对146株菌株进行细菌素检测,有10株菌能同时抑制S.aureus、E.coli、B.subtilis,结果见表1。其中YP36上清液对3种指示菌的抑菌直径均大于15 mm,对S.aureus的抑菌直径达19.50 mm,抑制能力最强,其抑制作用见图2。其余抑菌效果好的菌株有MC15-1、SL28和MC49-1,因此,选取这4株菌进行后面的研究。

表1 乳酸菌细菌素对指示菌的抑制作用Table 1 Antibacterial effects of lactic acid bacteria bacteriocin on indicator bacterial

图2 乳酸菌YP36细菌素对指示菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of lactic acid bacteria YP36 bacteriocin on indicator bacteria注:A:金黄色葡萄球菌;B:大肠杆菌;C:枯草芽孢杆菌。

2.2 乳酸菌产细菌素的特性

2.2.1 酸性物质和过氧化氢试验 Vázquez等[23]认为乳酸菌在生长时抑制其他菌株的生长的主要原因在于:乳酸菌能够产生酸、过氧化氢及细菌素等物质。

在排除乳酸、乙酸和过氧化氢试验中,无菌MRS液体培养基经乳酸、乙酸调至4株菌株发酵24 h后的pH后,以S.aureus为指示菌做抑菌试验,结果抑菌圈都为零,表明没有抑菌作用;YP36、MC15-1、SL28、MC49-1的发酵液经过氧化氢酶处理后进行抑菌试验,结果见表2。从表2可以看出,4株菌的发酵上清液经过氧化氢酶处理后均能够抑制乳酸菌的生长,抑菌直径与未处理的菌株发酵液相比,略有下降但不显著(P>0.05),表明过氧化氢不是主要的抑菌物质。

表2 过氧化氢酶处理对乳酸菌菌株抑菌活性的影响Table 2 Effect of catalase treatment on antibacterial activity of LAB strains

2.2.2 蛋白酶敏感性试验 上述4株乳酸菌发酵上清液经不同类型的蛋白酶处理后,试验结果如图3所示。与对照组相比,YP36发酵上清液经蛋白酶K、胃蛋白酶处理后,抑菌直径显著降低(P<0.05),表明YP36发酵上清液中抑菌物质对蛋白酶K、胃蛋白酶敏感;MC15-1发酵上清液经木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理后,抑菌直径显著降低(P<0.05);SL28抑菌物质对蛋白酶K和胰蛋白酶敏感(P<0.05);MC49-1对胰蛋白酶敏感(P<0.05)。乳酸菌发酵上清液经蛋白酶处理后,抑菌直径显著降低。试验结果表明发酵上清液中存在一种能够被蛋白酶分解的抑菌物质,初步判断抑菌物质具有蛋白质属性。

图3 蛋白酶处理对乳酸菌抑菌活性的影响Fig.3 Effect of protease treatment on antibacterial activity of LAB strains注:A:YP36;B:MC15-1;C:SL28;D:MC49-1；不同小写字母代表差异显著；图5同。

2.3 产细菌素乳酸菌的鉴定

对筛选到的4株抑菌活性高的乳酸菌提取其基因组DNA,PCR扩增16S rDNA后测序,测序结果在GenBank中进行同源性分析,并构建系统发育进化树。结果如图4所示,与YP36亲缘关系最近的是植物乳杆菌(LactobacilluplantarumMT231813.1);与MC15-1、MC49-1亲缘关系最近的是短乳杆菌(LactobacillusbrevisAB362619.1)和(LactobacillusbrevisFJ476121.1);与SL28亲缘关系最近的是布氏乳杆菌(LactobacillusbuchneriAB300611.1)。

图4 系统发育树的构建Fig.4 Phylogenetic relationships of four lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌生长曲线及其细菌素的抑菌活性

根据乳酸菌生长曲线及其细菌素的抑菌活性来掌握乳酸菌的生长情况与细菌素产量的关系,结果表明:乳酸菌在生长迟缓期时,对指示菌无抑制作用,当乳酸菌进入稳定期时,对指示菌的抑制作用逐渐趋于稳定。结果如图5所示:YP36在10 h进入稳定期,此时发酵上清液的抑菌直径呈上升趋势,在第20 h抑菌直径达到最大;MC15-1在16 h进入稳定期,而发酵上清液的抑菌直径在20 h达到最大;SL28菌株的生长量与抑菌物质呈同步增长态势,在菌株到达稳定期16 h时,抑菌直径达到最大;MC49-1在12 h进入稳定期,在16 h时抑菌直径最大。因此,综合考虑,选取20 h观察抑菌直径。

图5 乳酸菌生长曲线及其细菌素的抑菌活性Fig.5 The growth curve of lactic acid bacteria and the bacteriostasis activity of their barteriocin

2.5 乳酸菌细菌素稳定性试验

2.5.1 乳酸菌细菌素热稳定性试验 为了考察酒醅乳酸菌细菌素的热稳定性,将4株菌的细菌素分别在不同温度下处理30 min后进行抑菌活性测定,结果如图6所示,随着热处理温度的升高,YP36及SL28抑菌活性无显著变化(P>0.05)。MC15-1和MC49-1在4～60 ℃条件下抑菌直径无显著变化(P>0.05),在60～121 ℃时,抑菌直径随着温度的升高有所降低,当温度在121 ℃时,仍有抑菌活性,分别是4 ℃下的抑菌活性的68.4%和56.38%。试验表明,四株菌的抑菌物质均具有一定的耐热性。

图6 温度对乳酸菌细菌素抑菌活性的影响Fig.6 Effect of temperature on the bacteriestasis activity of LAB barteriocin

2.5.2 乳酸菌细菌素pH稳定性 为了考察酒醅乳酸菌细菌素的pH稳定性,将4株菌的发酵上清液调整到不同的pH后进行抑菌活性测定,结果如图7所示。从图7可以看出:4株菌的酸碱稳定性变化趋势非常相似,pH在2.0～4.0范围内,抑菌活性均无显著变化(P>0.05);pH在4.0～6.0时,抑菌活性略有下降;在pH达8.0时4株菌的抑菌活性均消失。试验结果表明:4种乳酸菌细菌素在酸性环境下活性较高。

图7 pH对乳酸菌细菌素抑菌活性的影响Fig.7 Effect of pH on the bacteviestasis activity of LAB barteriocin

2.5.3 乳酸菌细菌素对酿酒微生物的影响 为了考察乳酸菌细菌素对酿酒功能菌的影响,选取清香型酿酒环境中主要微生物S.cerevisiae、I.orientails作为指示菌进行抑菌试验。结果如表3所示:酒醅乳酸菌细菌素对所有实验的酵母菌无抑制作用。

表3 乳酸菌细菌素对酿酒微生物的影响Table 3 Effects of lactic acid bacteria bacteriocin on brewing microorganisms

3 结论

本研究利用牛津杯法从清香酒醅中分离得到10株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有抑菌活性的乳酸菌。用16S rDNA序列分析对金黄色葡萄球菌抑制最强的4株乳酸菌YP36、MC15-1、SL28、MC49-1。进一步对这4株菌的抑菌物质进行研究,排除乳酸、乙酸和过氧化氢后仍有抑菌活性,个别蛋白酶处理后抑菌活性会下降,表明抑菌物质是蛋白质或多肽。在pH稳定性实验中,4株菌抑菌物质都在酸性条件下抑菌活性较强，都具有一定的热稳定性。4株菌的细菌素对筛选酒醅来源酵母菌无抑制作用。