长效二氧化氯缓释剂的制备

孟天宇,刘英丹,娄永江

(宁波大学食品与药学学院,浙江宁波 315211)

二氧化氯是一种广谱杀菌剂,在使用过程中无残留、无毒害,同时可有效地杀灭大多数微生物,对芽孢、病毒和寄生虫等均有很好地杀灭作用[1]。然而ClO2性质活泼,在空气中的浓度超过10%时有爆炸危险,且受热、受光照容易发生分解或氧化[2]。为克服二氧化氯气体的使用局限性,人们开始研究固体二氧化氯缓释剂。

土仓满[3]最初用合成树脂吸附ClO2水溶液,制成吸附性二氧化氯固体,后又用硬脂酸、蛋白质骨胶等做硅胶替换合成树脂。Fujita[4]将亚氯酸钠、硅藻土和聚丙烯酸类树脂等按照一定比例混合,制成反应型二氧化氯固体缓释剂。周大军等[5]将稳定的ClO2高浓度溶液喷洒于固态多孔性硅胶中,制成一种二氧化氯固体缓释剂。但固体二氧化氯缓释剂主要存在着杀菌时间短、二氧化氯浓度不可控的问题,从而导致食品中的一些芽孢、孢子等无法被杀灭,在食品储藏中后期容易变质。同时,GB 2760-2014规定稳定态ClO2做防腐剂时最大使用量不超过50 mg/kg,初始ClO2浓度过高时,不符合我国国家标准。

因此,为了解决上述问题,本研究筛选不同种类活化剂、凝胶剂及氯盐,研究其对二氧化氯缓释剂缓释效果的影响,寻找最佳配比,旨在找到一种浓度可控、有效杀菌时间长、防腐效果优良的ClO2缓释剂,且降低杀菌剂对食品本身气味的干扰,将固体二氧化氯更好地应用于食品中。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

亚氯酸钠 萨恩化学技术(上海)有限公司;草酸、DL-酒石酸、乙二胺四乙酸、氯化钠、滑石粉(800目) America VWR International;氯化钙、氯化钾 国药集团化学试剂有限公司;硅藻土、海藻酸钠、可得然胶、卡拉胶、明胶 通化安柏生物科技有限公司;羧甲基纤维素钠 天津市光复精细化工研究所。

PFS-200型大功率手压封口机 东莞市青叶包装机械有限公司;XLA-BX-CLO2型便携式气体检测仪 深圳市普利通电子科技有限公司;Sigma 3k15型冷冻干燥机 德国希格玛公司;QUANTA-200型扫描电子显微镜 美国FEI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 长效二氧化氯缓释剂的制备 先称取10 g硅胶,一定量的亚氯酸钠和水,按比例混合均匀后得到悬浊液A,并将凝胶剂、氯盐和水混合均匀得到混合物B。然后将二者混合均匀,得到甲剂。接着,称取8.5 g硅胶,一定量的活化剂和水按照一定比例混合均匀,再加入粘合剂(22 g滑石粉)搅拌均匀,得到乙剂。进一步将甲乙两剂混合,得到二氧化氯保鲜剂固体。如图1所示。

图1 二氧化氯保鲜剂制备流程图Fig.1 Flowchart of preparation of chlorine dioxide preservative

1.2.2 活化剂、凝胶剂及氯盐种类的筛选

1.2.2.1 活化剂种类的选择 在保持18 g NaClO2用量一致的前提下,分别选择草酸(H2C2O4)、酒石酸(TA)和乙二胺四乙酸(EDTA)各1.8、3.0、5.8 g,选取可得然胶20 g,氯化钠15 g,制备二氧化氯保鲜剂。并在25 ℃,相对湿度90%,体积0.4 m3恒温培养箱内进行缓释,每5 d测定ClO2气体浓度,每组设置5次平行实验,计算其ClO2缓释速率和有效杀菌天数占比 。

1.2.2.2 凝胶剂种类的选择 在保持18 g NaClO2,5.8 g乙二胺四乙酸用量一致的前提下,分别称取20 g硅藻土(DE)、海藻酸钠(SA)、可得然胶(CUD)、卡拉胶(CAR)、羧甲基纤维素钠(CMC)、明胶(GEL),选取氯化钠15 g,制备二氧化氯保鲜剂,并在25 ℃,相对湿度90%,体积0.4 m3恒温培养箱内进行缓释,每5 d测定ClO2气体浓度,每组设置5次平行实验,计算其ClO2缓释速率和有效杀菌天数占比 。

1.2.2.3 氯盐种类的选择 在保持18 g NaClO2,5.8 g乙二胺四乙酸,20 g羧甲基纤维素钠,用量一致的前提下,分别称取46.8、44.4 g氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2),制备二氧化氯保鲜剂,并在25 ℃,相对湿度90%,体积0.4 m3恒温培养箱内进行缓释,每5 d测定ClO2气体浓度,每组设置5次平行实验,计算其ClO2缓释速率和有效杀菌天数占比 。

1.2.3 活化剂、凝胶剂及氯盐配方探究

1.2.3.1 活化剂、凝胶剂及氯盐用量的确定 根据1.2.2的初步筛选,确定最佳的活化剂为乙二胺四乙酸、凝胶剂为羧甲基纤维素钠,氯盐为氯化钠。在羧甲基纤维素钠10 g、氯化钠21 g不变的条件下,分别取5.8、2.9、2.0、1.5、1.0 g乙二胺四乙酸,且根据亚氯酸钠与氢离子的反应方程确定亚氯酸钠的量;在乙二胺四乙酸2 g、氯化钠21 g不变的条件下,分别取8、12、16、20、24 g羧甲基纤维素钠;在乙二胺四乙酸2 g、羧甲基纤维素钠10 g不变的条件下,取7、14、21、28、35 g氯化钠;根据1.2.1中的方法制备二氧化氯缓释剂,并在25 ℃,相对湿度90%,体积0.4 m3的恒温培养箱内进行缓释,每组设置5组平行实验。比较每组实验中二氧化氯气体浓度,选择合适的活化剂、凝胶剂及氯盐的用量。

1.2.3.2 活化剂、凝胶剂及氯盐质量比的确定 在单因素结果的基础上,以氯化钠(A)、乙二胺四乙酸(B)、羧甲基纤维素钠(C)为考察因素,采取正交实验对影响提取的上述主要因素进行工艺参数优化,如表1,记录二氧化氯气体浓度的变化规律,并计算其有效杀菌天数占比。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 ClO2气体浓度检测 称取2.0 g制得的二氧化氯保鲜剂固体,置于6 cm×8 cm灭菌后的无纺布透气型包装袋中并封口,然后将其放置于12 cm×18 cm密封袋中并封口。每天随机抽取每组样品5份,用ClO2气体检测仪检测密封袋中的ClO2气体浓度,共观察33 d。

1.2.5 ClO2缓释速率计算 每个样品缓释出的二氧化氯气体浓度降至1 mg/kg时,对大多微生物已不具有杀灭效果,故设置1 mg/kg为本研究中的最低有效浓度。ClO2缓释快慢程度,以降至1 mg/kg的时间的倒数V来表示,单位d-1。V越小,T越大,保鲜剂释放二氧化氯气体越缓慢,有效期越长。

式中:V表示ClO2缓释的快慢程度,d-1;T表示ClO2气体浓度降至1 mg/kg时所需要的时间,d。

1.2.6 有效杀菌天数占比 本研究中,有效杀菌天数占比(c)为ClO2气体浓度在1～50 mg/kg的天数(d)与总检测天数(D)的比值,用来表现缓释剂的杀菌效果。有效杀菌天数占比(c)越大,说明该保鲜剂缓释过程中,浓度不超过50 mg/kg且不低于1 mg/kg的时间越长。

1.2.7 二氧化氯缓释剂内部结构和形态特征观察 取缓释1 d的缓释剂和缓释15 d的缓释剂各1 g,放入2 mL圆底离心管,冷冻干燥48 h后取出,制成粉末状。用导电胶将样品粉末粘于样品台上,喷金,置于环境扫描电镜下[6-7],先在低倍下进行观察,然后在高倍下,观察其内部结构和形态特征。

1.3 数据分析

本研究中的实验均重复5次,采用描述统计、方差分析等处理方式,通过Origin 8.0(版本号:8.932.0.932)进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 活化剂、凝胶剂及氯盐的确定

图2 不同活化剂制得二氧化氯保鲜剂的缓释效果Fig.2 Slow-release of chlorine dioxide preservative with different activators

如图2所示,三种缓释剂的缓释速度相近,即释放出的二氧化氯气体的浓度低至1 mg/kg的时间相近,这是因为整个体系中可以发生反应的亚氯酸钠总量有限。乙二胺四乙酸(EDTA)做活化剂时,缓释剂的有效杀菌时间占比最大,比草酸做活化剂时提高了18%,比酒石酸做活化剂时提高了20%,在缓释过程中浓度在1～50 mg/kg的时间多于其他两种。所以,本实验选择乙二胺四乙酸为活化剂。

2.1.2 凝胶剂的确定 凝胶剂的微孔结构既可以吸附产生的ClO2气体,减缓ClO2的扩散速率,使ClO2气体缓慢地释放,又可以使包裹有NaClO2的硅胶均匀分布,从而降低整个反应过程中活化剂的弱酸离子的迁移速度,降低NaClO2的反应速率。

硅藻土(DE)内部结构多孔,可利用本身的负电性和吸附性吸附硅胶和NaClO2[8];海藻酸钠(SA)持水力强,有利于硅胶、NaClO2的附着[9-10];可得然胶(CUD)粘合性较好[11],可以将包裹发生剂的硅胶离子吸附至自身的孔洞中;卡拉胶(CAR)中阴离子性硫酸酯基团可以与游离水分子结合[12],使卡拉胶具有良好的吸水性,其他反应物分子也可进入其凝胶网络结构中[13];羧甲基纤维素钠(CMC)是由纤维素改性得到的大分子聚合物,具有很好的粘结力和持水力[14];明胶(GEL)在加热条件下,可形成凝胶混合物,使其他成分能够均匀的分布在明胶胶网络中[15]。故本研究选用这六种凝胶剂,分别制备二氧化氯保鲜剂并测量其二氧化氯气体浓度,比较二氧化氯气体缓释速率和有效杀菌天数占比,如图3所示。

图3 不同凝胶剂制得二氧化氯保鲜剂的缓释效果Fig.3 Slow-release of chlorine dioxide preservative with different gels

如图3所示,羧甲基纤维素钠(CMC)的缓释速度最低,有效杀菌时间占比最大,是因为CMC的粘结力和持水力较好,能均匀地粘结二氧化氯亚氯酸钠、硅胶及氯盐,保持了甲剂的均一性[16]。硅藻土(DE)和明胶(GEL)的缓释速度较大,这是因为加入硅藻土时,由于硅藻土的负电性,大量含有亚氯酸钠的硅胶离子被吸附,同时硅藻土呈弱酸性[17],一部分硅藻土表面的H+及硅羟键和NaClO2发生反应[18],产生大量的二氧化氯气体;明胶在缓释过程中能发生交联反应,形成缓释层,而且可在不同pH环境下形成不同电性的离子,干扰离子场的形成及活化剂中弱酸离子的迁移[19]。加入可得然胶(CUD)制得的缓释剂有效杀菌时间占比最低,因为可得然胶需在加热条件下,可形成高强度凝胶[20],在本研究中部分反应物未能与凝胶完全结合。所以,本实验选择羧甲基纤维素钠为凝胶剂。

2.1.3 氯盐的确定 在反应中加入凝胶剂后,部分活化剂和亚氯酸钠被阻隔。加入氯盐,可以在电势电位的作用下形成微电场[26],使带正电荷的弱酸在该环境下逐渐向微孔网络凝胶中迁移,与NaClO2接触产生ClO2气体。同时氯盐多为不发生反应的中性盐,可以起到钝化剂的作用,阻隔反应物直接接触。为此本研究选择了NaCl和CaCl2两种氯盐,比较二氧化氯气体缓释速率和有效杀菌天数占比,如图4所示。

图4 不同活化剂制得二氧化氯保鲜剂的缓释效果Fig.4 Slow-release of chlorine dioxide preservative with different chlorine salt

如图4所示,加入氯化钙的缓释剂的有效杀菌天数占比明显低于氯化钠作氯盐的缓释剂,这是因为CaCl2在提供电子的同时,也起到了吸湿剂的作用,CaCl2潮解[27]使保鲜剂中水分增加,反应物融合充分[28],反应更剧烈而达不到缓释的目的。所以,本实验选择氯化钠。

2.2 活化剂、凝胶剂及氯盐用量对二氧化氯气体浓度影响的结果

将分别加入8、12、16、20、24 g羧甲基纤维素钠制得的缓释剂,标记为CMC-1、CMC-2、CMC-3、CMC-4、CMC-5组,记录其二氧化氯气体浓度,浓度如图5a所示。五组试验中的二氧化氯气体浓度整体呈下降趋势,其中CMC-2组的初始浓度和最大浓度最低,第33 d时的浓度仍大于1 mg/kg。减少CMC的量到8 g(CMC-1组)时,其初始浓度略高于第二组;增加到16 g(CMC-3组)时,其初始浓度大于第二组且远超50 mg/kg 的浓度标准。所以该实验中,加入羧甲基纤维素钠最佳范围为8～12 g。

将分别加入5.8、2.9、2.0、1.5、1.0 g的乙二胺四乙酸制得的缓释剂,标记为EDTA-1、EDTA-2、EDTA-3、EDTA-4、EDTA-5组,如图5b所示。前4组缓释剂释放出的二氧化氯气体浓度呈先上升后下降趋势。其中第3组缓释剂的最高浓度小于国家标准要求且有效杀菌时间较长。第5组由于酸含量过少,亚氯酸钠可能未完全反应,导致产生二氧化氯气体过少,有效缓释时间短。所以该实验中,加入乙二胺四乙酸2 g最佳。

分别取7、14、21、28、35 g氯化钠制得的缓释剂,标记为NaCl-1、NaCl-2、NaCl-3、NaCl-4、NaCl-5组,如图5c所示。5组缓释剂在第33 d时的浓度均大于1 mg/kg,其中二氧化氯缓释浓度整体较低且有效杀菌时间最长的为第4组。所以该实验中,加入氯化钠28 g最佳。

图5 活化剂、凝胶剂及氯盐对二氧化氯气体浓度的影响Fig.5 Effects of activator,gel and chlorine salt on the concentration of chlorine dioxide

2.3 长效二氧化氯缓释剂最优配方比的确定

2.3.1 配方优化安排及结果分析 在2.2实验结果的基础上,选择NaCl为氯盐,EDTA为活化剂,CMC为凝胶剂,按照表1,对影响提取的上述主要因素进行工艺参数优化,采用正交表L9(34)进行三因素三水平试验,如表2所示。本正交试验的误差值小(0.02),数据可信。A、B、C三个因素的R值和空白列误差相比差异明显。三个因素对ClO2缓释过程的影响力依次为:NaCl>CMC>EDTA,影响最大的是NaCl,综合考虑确定最佳方案为CMC∶EDTA∶NaCl=14∶1∶5。

表2 配方优化结果分析表Table 2 Formula optimization analysis

2.3.2 配方优化结果验证 在25 ℃,相对湿度50%环境下,按优化后的配比,设置5组平行实验,记录ClO2气体浓度随时间的变化情况,如图6所示,优化后的缓释剂释放出的二氧化氯气体最高浓度不超过50 mg/kg,有效杀菌天数28 d,占比84.85%。

图6 二氧化氯气体浓度变化Fig.6 Change of chlorine dioxide concentration

2.3.3 不同缓释天数对二氧化氯缓释剂内部结构和形态特征的影响 在电镜下,放大650、1500、3000倍，分别观察缓释1 d和缓释15 d的保鲜剂的内部结构,如图7所示。配方优化后的二氧化氯缓释剂内部为致密的微孔网络结构,颗粒排列紧密且有一定规则。缓释剂中90%以上的微孔小于10 μm,图7a为刚开始释放ClO2的缓释剂内部结构,图7b为缓释15 d后的二氧化氯缓释剂的内部结构。比较两图可以看出,缓释剂的内部形态与缓释时间有关,1 d时,缓释剂刚开始反应并释放二氧化氯气体,内部微孔排列较紧密。15 d时,缓释剂内部微孔数量增加且孔隙略大,反应产生的二氧化氯气体储存在微孔结构中并缓慢释放到环境中。

图7 二氧化氯缓释剂内部结构Fig.7 Internal structure of chlorine dioxide sustained-release agent

3 结论

本研究研发了一种杀菌防腐效果佳,浓度可控制在国家标准范围内的ClO2缓释剂,将缓释型二氧化氯更好地应用于食品保鲜中。研究发现选用EDTA为活化剂,可使有效杀菌时间延长20%;选用羧甲基纤维素钠(CMC)为凝胶剂时,二氧化氯气体缓释速率最小且有效杀菌时间较长;选用NaCl为氯盐,提供微电场环境的同时能钝化反应物。当CMC、EDTA和NaCl的质量比为14∶1∶5时,得到的保鲜剂的有效杀菌时间(浓度为1～50 mg/kg的时间)达28 d。在电镜下观察优化后的保鲜剂,其内部结构为致密的微孔网络结构,颗粒排列紧密且有一定规则,反应产生的二氧化氯气体可储存在缓释剂的微孔结构中并实现缓慢释放。

本研究着重研发了缓释时间1个月左右的ClO2缓释剂。若想将二氧化氯更广泛的应用于食品保鲜或其他领域中,就需要进一步研究更有效的凝胶剂、钝化剂或其他缓释材料,或开发新型的包装材料和包装方式,使缓释剂有效期更长。