一株刺梨非酿酒酵母的分离鉴定、生理特性及混菌发酵研究

赵湖冰,黎 华,田 野,于志海,刘晓辉,黄名正,刘晓柱

(贵州理工学院,贵州贵阳 550000)

果酒是指鲜果经破碎、发酵而成的一种低酒精度饮品。除原料、工艺、设备等因素外,微生物在果酒酿造中扮演着至关重要的角色。果酒发酵中起主要作用的是酿酒酵母,其发酵活性强,酒精代谢旺盛。但非酿酒酵母菌作为果酒发酵过程中非接种发酵菌群,却对果酒风味及成分有着显著影响,其代谢及发酵作用在很大程度上影响果酒的复杂性[1-2]。在模拟葡萄汁中接种3株非酿酒酵母中,共检测出74种与酵母代谢相关的挥发性化合物,其中葡萄汁有孢汉逊酵母产生香气物质较为丰富,典型发酵香气包括乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、辛酸乙酯、辛酸-3-甲基丁酯、乙酸-2-苯乙酯、辛酸和香茅醇,赋予了葡萄酒复杂的果香和花香[3]。目前对非酿酒酵母的认识主要停留在葡萄酒等传统酿造领域,在其它果酒酿造中的了解还十分有限。

刺梨(Rosaroxburghii)蔷薇科、蔷薇属,多年生落叶丛生灌木植物,其果实中VC含量高达2200～2500 mg/100 g,是猕猴桃的10倍,故有“VC之王”美称。此外,刺梨果实中还富含多种维生素、多糖、胡萝卜素、黄酮类、三萜及苷类、过氧化物歧化酶等具有生物活性物质,是一种较好的果酒酿造源水果[4-5]。刺梨作为贵州省重点发展的特色产业之一,2018年全省种植面积达219.65万亩,生产总值达31.61亿元[6]。尽管刺梨具有丰富的营养价值和药用价值,但刺梨果实中含有较多的单宁,鲜果生食口感较差[7],因此,对刺梨进行深加工是刺梨产业发展的必然选择。利用刺梨鲜果发酵生产刺梨果酒是一种比较可行的刺梨加工方式。但目前,还缺乏刺梨果酒专用酵母。利用非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵果汁,包括共接种和顺序接种两种方式,可有效提高增加发酵果酒中香气物质成份或含量。但目前还未见有刺梨非酿酒酵母的报道。因此,本研究采用传统的微生物分离技术,从贵州刺梨鲜果上选育出一株产香浓郁的非酿酒酵母,分析了其生理特性,并与商业酵母进行混菌发酵,探讨其对刺梨果酒风味的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺梨为贵农5号 采自贵州龙里地区;商业化酿酒酵母ZYMAFLORE X16(简称X16) 法国LAFFORT公司;赖氨酸固体培养基 海博生物技术有限公司;对硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D glucopyranoside,p-NPG) 上海源叶生物科技有限公司;蔗糖 本地超市;其余试剂均为国产分析纯 购自贵州博奥瑞杰生物科技有限公司。

雷磁PHSJ-3F pH仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；UH5300紫外分光光度计 日本日立公司;CKX41-倒置显微镜 日本OLYMPUS公司;SZM体视显微镜 中国宁波舜禹仪器有限公司;电子舌味觉系统 日本Insent公司;Bio-rad T100TM PCR仪、GelDocXR凝胶成像系统 美国伯乐公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 YPD培养基:称取酵母浸粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,加热煮沸溶解于蒸馏水中,定容至1000 mL,pH自然。固体培养基另加入20 g琼脂,灭菌备用。使用时加入氯霉素100 mg/L。

WL培养基:称取酵母浸粉4 g、蛋白胨5 g、葡萄糖50 g、琼脂20 g,量取储存液A 40 mL(磷酸二氢钾13.75 g/L,氯化钾10.625 g/L,氯化钙3.125 g/L,七水合硫酸镁3.125 g/L),储存液B 1 mL(氯化铁2.5 g/L,硫酸锰2.5 g/L),储存液C 1 mL(0.44 g溴甲酚绿溶于10 mL无菌蒸馏水和10 mL 95%乙醇中),加热煮沸溶解于蒸馏水中,定容至1000 mL,pH自然。

赖氨酸培养基:称取赖氨酸培养基粉末66.3 g,量取8.4 mL 60%乳酸钾溶液,加热煮沸溶解于蒸馏水中,定容至1000 mL,冷却至50 ℃左右时,用16%乳酸溶液调整pH至4.8±0.2,混匀,倾入无菌平板中,备用。

亚硫酸铋琼脂培养基[8]:称取柠檬酸铋铵5 g、亚硫酸钠3 g、甘氨酸10 g、葡萄糖10 g、酵母浸粉1 g、琼脂15 g、加热溶解于1000 mL蒸馏水中,煮沸1 min,调节pH至6.8±0.2。

1.2.2 菌株分离与鉴定 参考徐亚男[9]、蒋文鸿[10]方法,称取100 g新鲜成熟刺梨在无菌研钵中轻轻捣碎,放入无菌250 mL锥形瓶中,密封置于28 ℃进行自然发酵,分别于发酵第1、3、5 d取样。采用梯度稀释法并涂布于YPD固体平板上,28 ℃培养48 h。然后挑取单克隆,继续划线于YPD固体平板上,直至为纯的单克隆为止。

YPD固体平板上纯的单克隆菌株划线于赖氨酸培养基上,28 ℃培养3 d,观察其生长情况,在赖氨酸培养基上可以生长的为非酿酒酵母。选YPD固体平板上纯的单克隆菌株划线于WL固体培养基上28 ℃,培养5 d,观察菌落颜色和形态,以鉴定非酿酒酵母的类别。挑取YPD固体平板上纯的单克隆菌株,置于显微镜观察细胞形态和生殖方式。

PCR扩增菌体26S rDNA D1/D2区域,进行分子鉴定。PCR反应体系包括Taq PCR Master Mix(2×)25 μL,引物NL1和NL4(10 μmol/L)各2 μL,菌液2 μL,反应体积为50 μL。反应结束后取5 μL PCR扩增产物产进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果在NCBI上进行BLAST同源序列搜索比对,采用MEGA X 构建系统进化树。

1.2.3 生长曲线测定 菌株以106CFU/mL接种于YPD液体培养基,28 ℃、180 r/min条件下培养,每隔4 h取样,以YPD液体培养基作为空白对照,在600 nm波长处测定菌悬液OD值,平行重复3次,共取样40 h。根据时间和OD600值绘制生长曲线。

1.2.4 菌株生理特性分析 以X16作为对照,培养菌株F16、X16并调整浓度至106CFU/mL。分别将F13、X16接种至不同处理组的YPD液体培养基中,糖处理组葡萄糖质量浓度为100、150、200、250、300 g/L,乙醇处理组乙醇体积分数为3%、6%、9%、12%、15%,酸处理组柠檬酸酸度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,SO2处理组SO2质量浓度分别为50、100、150、200、300 mg/L,单宁处理组为单宁浓度0、5、10、15、20、25 g/L,各处理组分别于28 ℃、180 r/min条件下培养34 h,在600 nm波长处测定菌悬液OD值,平行重复3次,以测定菌体对葡糖糖、乙醇、柠檬酸、SO2以及单宁的耐受性[11-12]。

1.2.5 硫化氢产生能力分析 参考王优蓓等[13]研究方法,用镊子夹取灭菌滤纸片贴于事先准备好的亚硫酸铋培养基表面,吸取10 μL浓度为106CFU/mL的菌液滴加在滤纸片上,待液体完全吸入培养基后,28 ℃倒置培养5 d,观察培养基变色情况。产H2S能力由高到低显色情况分别为显棕黑色、棕色、墨绿色、淡墨绿色及不显色。

1.2.6 产β-葡萄糖苷酶能力分析 采用对硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷(p-NPG)法分析菌株产β-葡萄糖苷酶能力。参照侯晓瑞等[14]文献方法制作标准曲线。绘制的标准曲线方程式为y=0.1302x+0.0226,R2=0.9995。

菌株以106CFU/mL接种于YPD培养基中,28 ℃、200 r/min培养72 h,取1 mL发酵液于离心管中,4 ℃、8000 r/min,离心10 min,取上清液作为粗酶液。取0.1 mL粗酶液与0.2 mL 35 mmol/L p-NPG混匀,40 ℃保温30 min,加入2 mL 1 mol/L Na2CO3终止反应,于400 nm波长处测定吸光度。酶活力单位(U)定义为pH5.0、50 ℃条件下,1 min水解p-NPG产生1 μmol p-NP所需酶量。

1.2.7 菌株混合发酵 将新鲜刺梨榨汁,调整其pH为3.5,糖度为24 °Bx。将非酿酒酵母F13和酿酒酵母X16种子液以1∶1比例混合接种于刺梨汁中,使其菌株终浓度为108CFU/mL。25 ℃恒温静置发酵,以糖度不再降低,酒精度不再增加判定发酵终点。以X16单独发酵作为对照,每个样本3个平行重复。发酵结束后,取刺梨果酒4 ℃、3000 r/min离心5 min去残渣,上清液用于后续分析[15-16]。

1.2.7.1 乙醇体积分数、总酸、挥发酸、pH测定 参照GB/T 15038-2006 《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17],进行刺梨果酒乙醇体积分数,总酸和挥发酸的测定。刺梨果酒pH测定采用pH仪进行。

1.2.7.2 总糖测定 采用李晓旭等[18]优化蒽酮法测定刺梨果酒总糖。采用乙酸乙酯配制15 mg/mL蒽酮溶液,0.2 mg/mL葡萄糖标准液。分别取葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中,稀释至2 mL,蒽酮试剂0.5 mL,冷水浴中加入浓硫酸5 mL,摇匀。迅速放入水浴锅中,80 ℃下水浴15 min,取出后流动水冷却至室温,在620 nm处测定其吸光度。以糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,绘制的标准曲线方程式为y=13.90x+0.038,R2=0.999。

采用GB/T 15038-2006 《葡萄酒、果酒通用分析方法》酸水解刺梨果酒,测定的值带入标准曲线换算为样品中葡萄糖值。

1.2.7.3 电子舌分析刺梨果酒感官特性 取刺梨酒样上清液80 mL倒入电子舌专用烧杯中进行检测,试验采用清洗溶液和刺梨果酒样本交替检测序列进行检测,清洗溶液为专用电极清洗液。采样时间120 s,采样速度为1次/s,每个样品平行测定3次,每个平行重复采集4次[19]。

1.2.7.4 HS-SPME-GC-MS分析刺梨果酒挥发性香气物质 借鉴李雪等[20]研究方法,取8 mL刺梨果酒,加入2.0 g NaCl,40 ℃水浴萃取刺梨果酒中挥发性香气物质。萃取头插入进样口中,180 ℃进行解吸附2 min。GC-MS分析条件为:PEG.20 m弹性石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm),1 mL/min流量的氦气为载气。进样口温度50 ℃,出样口温度235 ℃。离子源温度为230 ℃;四极杆温度为150 ℃,调谐EMV 947 V,质量扫描范围为30.00～500.00 amu。NIST 14.L标准谱库检索并匹配GC-MS采集得到的数据,进行定性分析。采用峰面积归一化法进行物质的定量分析。

1.3 数据分析

数据结果以平均值±标准差表示,Excel 2007进行作图。SPSS 17进行数据差异分析。两组均数间比较用成组t检验,多组均数间比较用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 非酿酒酵母的筛选与鉴定

赖氨酸培养基鉴定结果表明,刺梨自然发酵液中共分离得到80株非酿酒酵母。形态分析结果与测序分析结果发现,分离到的刺梨非酿酒酵母包括葡萄汁汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)、伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichiaburtonii)、克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)、Pichiasporocuriosa、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)五类。通过嗅闻法初筛后获得7株非酿酒酵母菌,进一步接入刺梨汁发酵后筛选出1株果香和酒香味较浓的酵母菌株,编号为F13,对该菌株进行了深入分析。

F13菌株显微形态为柠檬状,出芽繁殖(图1A);YPD培养基上菌落黄白色、有光泽、边缘整齐、凸起、表面湿润(图1B)。F13在赖氨酸培养基上生长良好,说明F13是一株非酿酒酵母(图1C)。F13在WL培养基上,菌落深绿色、边缘平整、光滑湿润(图1D)。因此,根据F13显微形态与菌落形态,初步认为F13为一株汉逊酵母(Hanseniasporasp.)。

图1 菌株F13细胞与菌落形态Fig.1 Cellular and colonial morphologies of the F13 strain注:A:菌株F13细胞显微镜形态(×400,bar=100 μm);B:菌株F13在YPD培养基菌落形态;C:菌株F13在赖氨酸培养基菌落形态;D:菌株F13在WL培养基菌落形态。

采用PCR方法扩增F13菌株26S rDNA D1/D2区域,PCR扩增产物BLAST结果表明,菌株F13与Hanseniasporauvarum菌株同源性较高,达97%相似性。因此,认为F13为1株来源于刺梨的葡萄汁有孢汉逊酵母,其进化树结果见图2。

图2 基于26S rDNA D1/D2区域序列构建的酵母菌菌株系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of yeast strains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence

2.2 非酿酒酵母F13生长曲线

非酿酒酵母菌株F13生长曲线如图3所示,前4 h为延滞期,4～16 h为对数生长期,16 h后达到稳定期。在对数生长期F13生长速率小于商业化的酿酒酵母X16,且对数生长期时间比X16长;稳定期阶段F13与X16生长特性较为一致。

图3 非酿酒酵母F13生长曲线Fig.3 Growth curve of non-Saccharomyces cerevisiae F13 strain

2.3 非酿酒酵母F13生理特性分析

葡萄糖耐受性结果如图4A所示,菌株F13与商业化酿酒酵母X16在100～300 g/L葡萄糖浓度范围内,均可生长。但各浓度葡萄糖处理下,F13菌体浓度均显著低于X16。

图4 非酿酒酵母F13耐受性分析Fig.4 Tolerance of non-Saccharomyces cerevisiae F13 strain注:A:葡萄糖耐受性;B:柠檬酸耐受性;C:乙醇耐受性;D:二氧化硫耐受性;E:单宁耐受性;与X16组相比,*代表差异显著,P<0.05。

酸耐受性结果如图4B所示,菌株F13在酸度1.0%～3.0%范围不受影响,均可生长,其生长量与商业化酿酒酵母X16相比无显著差异,表明非酿酒酵母F13菌株具有较强的酸耐受性。

乙醇耐受性如图4C所示,F13酒精耐受性随着乙醇体积分数的增大而逐渐降低,在乙醇体积分数6%时生长受到明显抑制。与商业化酿酒酵母X16相比,F13乙醇耐受性显著降低。

SO2耐受性结果如图4D所示,F13菌株生长量在SO2质量浓度50～300 mg/L范围内均可生长,波动较小,表明F13可耐受300 mg/L SO2。此外,F13在SO2不同浓度下,其生长量与酿酒酵母X16之间无显著区别。

单宁为多酚类高度聚合化合物,可与蛋白质和消化酶形成难溶于水复合物,具有抗菌抑菌作用。刺梨中含有大量单宁,含量一般在0.6%～2.2%之间[21]。F13单宁耐受性如图4E所示,F13菌株生长量在单宁浓度0～25 g/L范围内均可生长,波动不大,表明,F13可耐受25 g/L 的单宁。此外,F13在单宁不同浓度下,其生长量与酿酒酵母X16之间无显著区别。

2.4 硫化氢产生能力

在酒类酿造中,酵母菌通过自溶,蛋白质分解可产生H2S。H2S具有大蒜味或臭鸡蛋味,少量存在即可对酒体风味带来不良影响。此外,H2S还能与醇类物质反应生成有害健康的低级硫醇。如图5所示,F13在亚硫酸铋琼脂平板上滤纸片为无色,即不产生硫化氢。商业化酿酒酵母X16平板上滤纸片为棕色,说明具有较强的H2S产生能力。因此,非酿酒酵母F13产H2S产生能力小于X16。王汝瑱[22]对从宁夏贺兰山东麓三个酒庄分离得到的菌株产H2S产生能力进行了分析,发现酿酒酵母都具有较强的H2S产生能力,而分离得到的非酿酒酵母葡萄汁有孢汉逊酵母不产H2S,与本研究结果一致。

图5 亚硫酸铋琼脂平板法分析非酿酒酵母F13硫化氢产生能力Fig.5 Analysis of hydrogen sulfide production ability of non-Saccharomyces cerevisiae F13 strain by barium sulfite agar plate method注:A:F13;B:X16。

2.5 β-葡萄糖苷酶产生能力

以对硝基苯酚浓度为横坐标,400 nm波长下的吸光值为纵坐标,绘制的标准曲线如图6所示。标准曲线回归方程为:y=0.1302x+0.0226,R2=0.9995,吸光值与对硝基苯酚浓度之间为线性关系。菌株F13产β-葡萄糖苷酶结果如表1所示,β-葡萄糖苷酶产生能力较低。商业酿酒酵母X16产β-葡萄糖苷酶量约为F13产酶量的2倍。

表1 p-NPG显色法产β-葡萄糖苷酶能力测定Table 1 Determination of β-glucosidase production by p-NPG chromogenic method

图6 对硝基苯酚溶液标准曲线 Fig.6 Standard curve of p-nitrophenol solution

2.6 非酿酒酵母F13对刺梨果酒品质的影响

2.6.1 非酿酒酵母F13对刺梨果酒常规理化指标的影响 利用非酿酒酵母F13与商业化酿酒酵母X16混合发酵刺梨,以X16纯种发酵为对照,分析F13对刺梨果酒品质的影响。刺梨果酒基本理化指标如表2所示,F13混合发酵刺梨果酒的pH、总酸与X16纯种发酵刺梨果酒相比,无显著区别;F13混合发酵刺梨果酒的总糖高于X16纯种发酵刺梨果酒,酒精度、挥发酸则低于X16纯种发酵刺梨果酒。表明,F13混合发酵显著影响刺梨果酒的残糖量、酒精度和挥发酸含量。

表2 刺梨果酒的理化指标Table 2 Physical and chemical indicators of Rosa roxburghii wine

由表2可知,F13与X16混酿刺梨果酒降酸能力大于纯种X16,因此刺梨果酒酿造中加入非酿酒酵母F13具有一定降酸效果。Bely等[23]采用德尔布有孢酵母与酿酒酵母混酿时,葡萄酒中挥发酸含量减少53%;Kapsopoulou等[24]采用耐热克鲁维酵母和酿酒酵母混酿是也可实现生物降酸作用,与本研究结果一致。

2.6.2 非酿酒酵母F13对刺梨果酒感官品评的影响 采用电子舌分析了非酿酒酵母F13对刺梨果酒感官品评的影响,结果如图7所示,采用非酿酒酵母F13与酿酒酵母X16混合发酵刺梨果酒与酿酒酵母X16纯种发酵刺梨果酒,在咸味、酸味、苦味、涩味、鲜味、丰富度、后味A、后味B响应值上均无显著差异,表明非酿酒酵母F13与酿酒酵母X16混酿与纯种酿酒酵母X16酿造刺梨果酒相比,在感官品评方面无显著影响。

图7 刺梨果酒滋味属性雷达图Fig.7 Taste attribute radar chart of Rosa roxburghii wine

2.6.3 非酿酒酵母F13对刺梨果酒香气物质的影响 利用HS-SPME-GC-MS技术测定非酿酒酵母F13与酿酒酵母X16混合发酵刺梨果酒(F13+X16)挥发性香气物质成分。如图8所示,F13混合发酵刺梨果酒中共检出41种香气物质,包括醇类12种、酯类15种、醛酮类3种、其他类11种;酿酒酵母X16纯种发酵刺梨果酒检中检测出41种香气成分,其中醇类11种、酯类17种、醛酮类3种、其他类10种。F13+X16混合发酵比X16纯种发酵减少了酯类物质的种类,增加了醇类和其它类物质的种类。F13+X16混合发酵酯类物质总量较X16组相比也发生显著性降低,但醇类物质总量显著性增加,醛酮类类物质和其它种类物质总量变化不显著。

图8 刺梨果酒香气物质种类及含量Fig.8 The aroma substances and their contents in Rosa roxburghii fruit wine注:与X16组相比,*代表差异显著,P<0.05。

2种刺梨发酵果酒中主要的酯类物质均为辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、癸酸乙酯和2-糠酸乙酯,其在F13+X16发酵刺梨果酒酯类物质比例分别为45.3%、19.7%、13.7%、6.6%和3.8%。庚酸甲酯为F13+X16发酵刺梨果酒中所特有香气物质,异丁酸乙酯、己酸甲酯、十一酸甲酯为X16纯种发酵刺梨果酒中所特有物质;2种刺梨发酵果酒中主要的醇类物质均为苯乙醇、正己醇和正辛醇,其在F13+X16发酵刺梨果酒醇类物质中比例分别为73.2%、5.1%、4.4%。

3 讨论与结论

本研究对刺梨自然发酵果汁中的非酿酒酵母进行了分离和鉴定,赖氨酸培养基共鉴定出80株非酿酒酵母,鉴定出包括Hanseniasporauvarum、Hyphopichiaburtonii、Pichiakluyveri、Pichiasporocuriosa、Wickerhamomycesanomalus五大类。通过嗅闻法从中筛选出一株产香较为浓郁的F13菌株做深入分析,形态学与分子生物学结果表明该菌株属于Hanseniasporauvarum。生理特性进一步研究表明,该菌株具有高耐糖、高耐酸、高耐SO2、高耐单宁、不产H2S等优点,具有一定的商业开发潜力。但与商业化的酿酒酵母相比,其酒精耐受性,产β-葡萄糖苷酶量等方面还稍逊一筹;同时在菌体生长的稳定期前,其生长速率还低于商业化酿酒酵母。所以,还需要采用传统育种技术或现代化的基因工程育种方式,对该菌株进行改造,使其具有更好、更优的生理特性。

共接种F13菌株与酿酒酵母X16菌株进行混合发酵刺梨果酒,果酒中的乙醇体积分数、总酸和挥发酸等指标均低于酿酒酵母纯种发酵刺梨果酒;而残糖量高于酿酒酵母X16纯种发酵刺梨果酒。尽管F13菌株混合发酵对刺梨果酒的感官评价未产生影响,但增加了刺梨果酒醇类物质的种类和含量,如具有玫瑰香特性的苯乙醇在F13混合发酵果酒中含量高于X16单一菌种发酵果酒。此外,非酿酒酵母通过可分泌多种胞外酶,分解果汁中香气前体物质,有助于丰富果酒中香气物质的种类和含量,本研究仅测定了该菌株β-葡萄糖苷酶的产生能力,测定酶的种类有限,其蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶等其它酶类还需要做进一步的研究,以进一步分析该菌株的产酶特性。

综上,本研究首次报道了从贵农5号刺梨果实中分离与鉴定非酿酒酵母,并进行了混合发酵刺梨果酒研究,该研究为进一步提升刺梨果酒品质奠定了基础,在后期的研究中,将扩大菌株的研究种类,为刺梨酿造筛选更多优质本土酵母,同时也将进一步进行放大生产,进行中试化试验。