响应面法优化三七渣固态发酵产红色素工艺

2020-08-17卢上飞谭显东时金栋羊依金郭旭晶

食品工业科技 2020年16期

卢上飞,谭显东,黄凡,时金栋,羊依金,郭旭晶

(成都信息工程大学资源环境学院,四川成都 610225)

目前红曲色素是世界上唯一发现的由红曲菌发酵而得的天然混合色素,至今已经发现了超过50种红曲色素。红曲色素作为红曲霉主要的次级代谢产物,广泛应用于食品工业,如添加到肉制品[1]、奶制品、水产品、果品、饼干等各类食物中[2-3],此外红曲色素还具有抗菌、防腐、抗癌、抗炎、调节胆固醇以及预防和治疗糖尿病等功效[4-7],在医药工业[8-9]和化妆品行业[10]的应用前景也受到广泛关注。

通过液态发酵和固态发酵两种发酵工艺都可获得高产红曲色素[11]。相较而言,液态发酵生产红曲色素产量偏低制约了其工业化生产。相比于液态发酵,固态发酵具有废水产生量少、能耗低、设备和技术相对简单、投资较低、不需要使用消泡剂等优点,再加上固态发酵能为菌丝体提供载体,因此该工艺生产红曲色素的产量远高于液态发酵[12]。目前,固态发酵生产红曲色素通常采用大米、高粱、玉米、大豆等粮食作物作为发酵底物,其中以大米为主[13]。也有研究人员采用豆渣[14]、粗甘油[15]、马铃薯葡萄糖培养基等[16]作为发酵培养基生产红曲色素。三七是一种传统的药食两用植物,提取有效成分后的三七渣主要采用焚烧、填埋等传统方法处理,既污染环境又浪费资源。近年来,研究人员就三七渣的资源化利用开展了大量研究工作,如将其用于生产蛋白饲料[17]、生物农药[18]、灵芝菌质[19]、提取黄酮[20]。

为了拓宽三七渣资源化利用的途径,降低红色素的生产成本,促进中成药行业的清洁生产,实验开展了三七渣固态发酵生产红曲色素的研究工作。本次研究以红色素产量(色价)作为评价指标,在单因素实验的基础上,通过响应面法优化三七渣固态发酵生产红曲色素的工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三七渣取自四川某中成药厂,药渣经晾晒、80 ℃干燥72 h后粉碎、过筛后置于干燥器中备用,其主要成分为:粗淀粉33.13%,粗蛋白12.28%,真蛋白9.97%,还原糖1.37%[21];紫色红曲霉(SICC 3.19) 四川省微生物资源平台菌种保藏中心;MgSO4·7H2O、无水乙醇、NaNO3、KH2PO4、葡萄糖分析纯,成都市科龙化工试剂厂。

UV-2550紫外可见分光光度计日本SHIMADZU公司;LDZX-50KB高压灭菌锅上海申安医疗器械厂;PYX-280H-C恒温恒湿生化培养箱广东韶关科力实验仪器有限公司;SF-130中药分析研磨机长沙中南制药机械厂;VT1300L-U超净工作台苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培养基:市售新鲜土豆20.0 g,葡萄糖2.0 g,琼脂粉2.0 g,蒸馏水100 mL,121 ℃灭菌30 min,用于紫色红曲霉菌种扩大培养与保藏。

种子液培养基:葡萄糖6%,蛋白胨2%,NaNO31%,MgSO4·7H2O 0.5%、KH2PO41%,pH自然,121 ℃灭菌30 min,用于紫色红曲霉种子液的制备。

三七渣固态培养基:过60目筛的三七渣10.0 g,蛋白胨0.3 g,磷酸二氢钾0.1 g,初始含水量60%,pH自然,121 ℃灭菌30 min,用于固态发酵实验。

1.2.2 单因素实验用打孔器在PDA培养基的边缘打取0.5 cm2的红曲霉菌丝块,接入种子液培养基中,置于恒温振荡器,在150 r/min、30 ℃条件下培养5 d;再按15%的接种量(V/W),将紫色红曲霉种子液接入装有三七渣固体培养基的250 mL三角烧瓶中进行恒温培养:若无特殊说明,装样量为10.0 g、培养温度为30 ℃、培养时间为10 d。恒温培养结束后测定红色素色价。分别考察装样量(5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 g)、培养温度(26、28、30、32、34、36 ℃)、培养时间(6、7、8、9、10、11、12 d)对固态发酵结果的影响。

1.2.3 发酵工艺条件优化实验在单因素实验的基础上,采用响应面分析法对发酵工艺条件进行优化。以装样量、培养温度、培养时间为影响因素,以红色素色价为响应值,进行Box-Behnken试验设计,实验因素及水平设计见表1。

表1 实验因素及水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.4 红色素色价测定方法将1.00 g发酵培养物放入50 mL浓度为70%的乙醇溶液,于60 ℃水浴提取60 min,在波长500 nm处测定提取液OD值[22],采用相同工艺对未发酵的培养基进行提取,将提取液作为空白对照。

红色素色价(U/g)=(OD500×50)/所称取的发酵培养物质量(g)

1.3 数据处理

本次研究中,若无特别说明,每组实验均有3个平行样,通过SPSS 17.0软件对单因素试验数据进行方差分析,单因素实验结果以平均值±标准差表示。利用Design Expert 8.0.6.1软件建立回归方程,并对回归方程进行检验,分析各单因素及因素间交互作用对红色素色价的影响,优化发酵工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 装样量对红色素色价的影响装样量对红色素色价的影响见图1。由图1可知,红色素色价随着装样量的增加先逐渐增大,在装样量为10 g时,色价达到峰值,随后,随着装样量的继续增大,红色素的色价反而逐渐降低。这与Huang等[23]利用不同培养基发酵红曲霉时观察到的现象相似。可能是由于适量的增加发酵培养基可以给微生物提供更充足的营养,从而促进微生物的生长和代谢产物的生成。同时,发酵过程中微生物的新陈代谢活动会释放大量的热和水分,使得物料黏度变大、温度升高。因此,过多的发酵物料会影响发酵体系的通风、供氧和散热,影响微生物的生长,进而影响代谢产物的生成[24-25]。

图1 装样量对红色素色价的影响Fig.1 Effect of loading amount on color value of red pigment

2.1.2 培养温度对红色素色价的影响培养温度对红色素色价的影响见图2。由图2可知,温度为26～30 ℃时,红色素的色价逐渐增大,在30～32 ℃达到最大;继续提高培养温度导致红色素色价逐渐下降,这与蒋冬花等[26]、金宏杰等[27]的研究结果基本一致。温度是影响微生物生长与繁殖的关键因素之一,过低和过高的温度均不利于红曲霉的生长[28],同时还会抑制细胞内酶的活性,进而导致其代谢水平较低;而合适的培养温度能够促进微生物的生长和次级代谢产物的生成。Liu等[29]发现合适的培养温度能明显提高红色素的产量,Yang等[30]也有类似实验结果。

图2 培养温度对红色素色价的影响Fig.2 Effect of culture temperature on color value of red pigment

2.1.3 培养时间对红色素色价的影响培养时间对红色素色价的影响见图3。由图3可知,总体上红色素色价随时间的增加而逐渐增加,但在不同的培养时间区段内,红色素色价的变化趋势有较大的差异:发酵第7～10 d时红色素的色价基本维持不变,发酵第10～11 d时,红色素的色价急剧增加,随后又维持相对稳定。培养时间直接影响到发酵产品的质量、收率和生产成本,培养时间过短时,微生物未能适应环境,基质中的营养物质也未能充分利用,随着培养时间增加,微生物生长代谢逐步旺盛,其代谢产物也逐渐积累,故红色素色价随着培养时间的增加而逐渐增加。Huang等[31]发现选择合适的发酵时间,能很大程度决定微生物的产物数量及带来的经济效益。在现实生产中,为了提高产量、降低生产成本应该综合考虑产品产量和发酵时间的关系[32]。

图3 培养时间对红色素色价的影响Fig.3 Effect of culture time on color value of red pigment

2.2 发酵工艺条件优化实验

2.2.1 响应面实验设计与结果响应面实验结果及预测值见表2。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

2.2.2 数学模型的建立及方差分析利用Design Expert 8.0.6.1软件对表2中红色素色价实验数据进行多元回归拟合,得到红色素色价与培养时间、培养温度、装样量的二次回归方程为:

Y=15.93+1.04A-0.41B+0.30C-0.11AB+0.22AC-0.067BC+0.029A2-1.25B2-1.07C2。

对回归模型进行显著性检验和方差分析,结果见表3。由表3可知,培养时间、培养温度和装样量对红色素色价的影响极显著(P<0.01);影响顺序依次为:培养时间>培养温度>装样量。模型F值为43.37,P<0.0001,说明整个模型回归效果极显著;模型中A、B、C、B2、C2均极显著(P<0.01),AB、AC、BC、A2均不显著。根据软件计算结果,回归方程的决定系数为0.9597,说明该模型可以解释大约95.97%的红色素色价响应值的变化;校正决定系数为0.9824,说明红色素色价的实测值与预测值之间的拟合度比较好,实验误差小;模型变异系数为0.801%,远小于10%,表明模型可信度和精确度较高。综上所述,可用此回归模型和方程来分析、预测红色素色价。

表3 回归模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

2.2.3 不同因素及其交互作用分析利用Design Expert 8.0.6.1软件绘制回归模型的三维响应曲面图,考察不同因素之间的交互作用对红色素色价的影响。三维响应面图坡度陡峭或平缓,代表响应值对于试验因素的改变是否敏感[33],各因素中,培养时间对红色素色价的影响最为显著,响应曲面坡度陡峭,随着培养温度的升高红色素色价出现先增后减的趋势;其次,培养温度比装样量的影响相对显著些,装样量响应曲面坡度相比培养温度稍微平缓。该结论与方差分析结果一致:各因素对红色素色价的影响顺序为培养时间>培养温度>装样量。

固定装样量为10 g,培养时间、培养温度交互作用对红色素色价影响的响应面图及等高线图见图4。

图4 培养时间和培养温度对红色素产量的影响Fig.4 Effect of culture time and culture temperature on the yield of red pigment

从图4可知,培养时间和培养温度对红色素色价有着不显著的交互作用,当培养时间处于低水平时,随着培养温度的升高,红色素色价先增加后减少。

固定培养温度为31 ℃,培养时间、装样量交互作用对红色素色价影响的响应面图及等高线图见图5。

图5 培养时间和装样量对红色素产量的影响Fig.5 Effect of culture time and loading amount on the yield of red pigment

从图5可知,培养时间和装样量对红色素色价有着不显著的交互作用,当培养时间处于低水平时,随着装样量的升高,红色素色价先增加后减少。

固定培养时间为12 d,培养温度、装样量交互作用对红色素色价影响的响应面图及等高线图见图6。

图6 培养温度和装样量对红色素产量的影响Fig.6 Effect of culture temperature and sample loading on the yield of red pigment

由图6可知,培养温度和装样量之间存在不显著的交互作用。当培养温度处于低水平时,随着装样量的升高,红色素色价先增加后减少。

2.2.4 工艺条件的优化及验证实验以红色素色价为响应值,利用Design Expert 8.0.6.1软件求解回归方程并修正后得到的最优工艺条件为:培养时间12 d,培养温度30.6 ℃,装样量10.63 g。在此条件下,红色素色价的预测值为17.12 U/g。验证实验得到的红色素色价为(16.83±0.104) U/g,与预测值的相对偏差为1.69%,实验值与预测值之间无显著差异,说明该回归模型拟合较好,得到的优化参数准确性高。