雌激素受体1基因多态性与不明原因复发性流产关系

白爱红 李荣香 谢文燕 滕少侠 胥 博 周美霞 付秀虹

河南省漯河市中心医院(462000)

不明原因复发性流产(URSA)在妊娠者中发生率为1%[1]，发病机制可能与基因多态性有关[2]。雌激素主要通过雌激素受体(ESR)发挥作用,其中雌激素受体1(ESR1)在排卵、卵泡生长发育中发挥重要的调控作用[3]。研究发现ESR1基因多态性与乳腺癌、子宫内膜癌、子宫肌瘤等发生有关[4]，与URSA关系研究不多。本研究通过对URSA患者血清中ESR1基因型分布进行分析，探究ESR1基因型与URSA发生的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年4月—2018年7月本院治疗的URSA患者88例，年龄(31.7±5.7)岁(20～37岁)。纳入标准：①经临床诊断、家族史、体查、辅助检测等确诊；②自然流产≥2次，孕期≤3个月；③生殖器官正常，伴侣双方染色体正常；④患者知情同意。排除标准：①严重感染者；②黄体功能不全者；③甲状腺功能异常、糖尿病；④免疫系统异常，如系统性红斑狼疮、抗精子抗体阳性；⑤不良生活习惯，吸烟、酗酒。另选同期本院体检的70例健康女性作为对照组，年龄(32.7±6.2)岁(22～38岁)，妊娠≥3次。两组年龄比较无差异(P>0.05)。

1.2 样本采集

所有受试者入院后采集静脉血离心保存上清，-20℃保存；于月经周期2～3d采集静脉血，检测血清激素水平。

1.3 检测方法

1.3.1主要试剂与仪器血液DNA提取试剂盒购于美国Sigma Aldrich公司；ESR1基因rs22234693、rs9340799、rs2046210 位点扩增引物由上海生工合成；PCR扩增试剂盒购于日本Takara公司；E2检测试剂盒购于武汉博士康生物工程有限公司；促卵泡生成激素(FSH)检测试剂盒购于武汉明德生物科技股份有限公司;促黄体生成激素(LH)检测试剂盒购于上海信裕生物科技有限公司。

1.3.2基因分型检测采用聚合酶链式反应-限制性片段多态性法(PCR-RFLP)检测ESR1基因rs22234693、rs9340799、rs2046210位点多态性，50 μl PCR反应体系：5μl Taq Buffer 5μl，3μl MgCl2溶液，位点上下游引物各2μl，1μl dNTP Mix，4μl DNA样品，0.5μl Taq DNA，补充dd H2O至50μl。扩增程序设定为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，退火45 s(rs22234693温度60℃，rs9340799温度64.3℃，rs2046210温度62℃)，40个循环。反应结束后，取2μl PCR反应产物置于琼脂糖凝胶电泳中观察条带变化，回收产物条带送公司测定序列。

1.3.3血清激素测定采用酶联免疫吸附法检测血清雌二醇 (E2)水平，化学发光法检测FSH水平，胶体金法检测血清LH水平。

1.3.4结果判定根据电泳条带，确定ESR1基因多态性。①rs22234693野生型纯合子CC型，1条带1300bp；CT型3条带 1300bp、850bp、450bp；突变纯合子TT型，2条带850bp、450bp；②rs9340799 野生型纯合子AA型，1条带1300bp；AG型 3条带，1300bp、910bp、390bp； 突变纯合子TT型，2条带910bp、390bp；③rs2046210 野生型纯合子CC型，1条带1300bp； 杂合子CT型 3条带，1300bp、875bp、425bp；突变纯合子TT型，2条带875bp、425bp。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组一般资料比较

URSA组FSH水平高于对照组，E2、LH水平低于对照组(P<0.0.5)。见表1。

表1 两组性激素水平比较

2.2 ESR1基因多态性

rs22234693存在单核苷酸多态性，包括野生型纯合子CC型，1条带1300bp；突变杂合子CT型共3条带，1300bp、850bp、450bp；突变纯合子TT型，2条带850bp、450bp。rs9340799存在单核苷酸多态性，包括野生型纯合子AA型，1条带1300bp；突变杂合子AG型共3条带，1300bp、910bp、390bp；突变纯合子TT型，2条带910bp、390bp。rs2046210 存在单核苷酸多态性，包括野生型纯合子CC型，1条带1300bp；突变杂合子CT型共3条带，1300bp、875bp、425bp；突变纯合子TT型，2条带875bp、425bp。电泳见图1。

图1 rs22234693、rs9340799、rs2046210 PCR-CTPP产物电泳图

2.3 Hardy-Weinberg遗传平衡验证

两组ESR1基因rs22234693、rs9340799、rs2046210位点实际基因频率与预测值比较无差异(P>0.05)；ESR1基因rs22234693、rs9340799、rs2046210位点基因频率表现稳定，符合 Hardy-Weinberg遗传平衡定律。见表2。

表2 两组ESR1基因各位点遗传平衡检验(实际值/理论值)

2.4 各组各基因型频率对比

URSA组rs22234693位点T等位基因、rs9340799位点G等位基因、rs2046210位点T等位基因频率均高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 各组各基因型位点频率对比

2.5 各基因型与激素水平关系

rs22234693、rs9340799、rs2046210位点突变型者血清E2、LH水平有差异(P<0.05)，FSH水平比较无差异(P>0.05)。见表4。

表4 ESR1各位点基因分型性激素水平比较

2.6 URSA发生风险的logistic回归性分析

多因素回归分析显示，以rs22234693 CC等位基因、rs9340799 AA等位基因、rs2046210 CC等位基因作参照，rs22234693 TT和TC基因携带者发生URSA风险的相对危险度分别为CC等位基因的1.756倍和2.432倍，rs9340799 GG、AG基因携带者发生URSA风险的相对危险度分别为AA等位基因的1.237倍和1.746倍，rs2046210 TT和TC基因携带者发生URSA风险的相对危险度分别为CC等位基因的1.354倍和1.824倍，均有更高发生风险(P均<0.05)。见表5。

表5 ESR1基因多态性与URSA发生风险的logistic回归分析

3 讨论

URSA发病机制较复杂，目前研究认为自身免疫疾病、内分泌异常、基因异常是导致其发病的重要原因，但具体机制尚未阐明[5]。近期研究显示其发病机制可能与URSA基因多态性相关，如免疫相关基因、内分泌相关基因等[6]，探究URSA基因多态性对该病的诊断、治疗有积极意义。

ESR基因包含ESRɑ(ESR1)与ESRβ(ESR2)两个亚基，目前研究较多的热点ESR1多态点为rs22234693、rs9340799，位点发生基因突变后影响后续的转录、蛋白表达，使ESR1蛋白功能发生异常，导致组织ER生物效应改变。多项研究证实ESR基因多态与肿瘤、肥胖、骨质疏松等疾病的发生密切相关[7-8]。

rs22234693位点为ESR1基因主要功能转录区域，该位点突变影响蛋白表达,引发各种疾病。Elbeshbishy等通过对子痫前期及正常妊娠者进行对照研究显示，rs22234693位点C→T突变可增加子痫前期发病风险[9]。Boudjenah等研究显示rs22234693位点基因多态性与妊娠率有关，CC、TC基因型携带者卵泡数量显著高于TT基因携带者，妊娠率低于TT基因携带者[10]。Pan等研究发现rs22234693位点基因多态性与URSA相关[11]。Silva等研究发现rs22234693位点多态性影响绝经后妇女月经周期和生殖参数[12]。本研究发现URSA患者rs22234693位点CC、TC、TT基因型频率比较有差异性，且T等位基因频率显著高于对照组，提示rs22234693位点多态性可能与URSA有关。临床分析显示两组rs22234693位点血清E2、LH水平具有差异，提示rs22234693位点突变后影响ESR1转录、蛋白表达，导致ESR1蛋白功能发生异常，可能进一步影响血清E2、LH。logistic分析发现rs22234693位点rs22234693 TT和TC基因携带者的发生URSA风险的相对危险度分别为CC等位基因的1.756倍和2.432倍，推测rs22234693位点C基因型突变为URSA发生的危险因素。

rs9340799位点基因多态性与多类疾病的发生有关[13-14]。近期发现与妊娠并发症有关，例如rs9340799位点GG基因型与重度子痫前期有关[15]。Anousha等研究认为自然流产患者rs9340799位点存在基因多态性，可能是造成自然流产的原因[16]。最新一项研究认为ESR1 rs9340799多态性与非亚洲组RSA风险增加有关，而与亚洲组发生RSA风险无关，这可能与种族差异有关[17]。本研究发现URSA组rs9340799位点AA、AG、GG基因型比较有差异性，且G等位基因频率显著高于对照组，提示rs9340799位点多态性可能与URSA有关。临床分析显示两组rs9340799位点血清E2、LH水平具有差异，提示rs9340799位点突变后影响ESR1转录，造成ESR1蛋白水平、功能异常，进一步影响血清E2、LH水平。logistic分析发现rs9340799位点 AG、GG基因携带者发生URSA风险的相对危险度分别为AA等位基因的1.237倍和1.746倍，推测rs9340799位点A基因型突变为URSA发生的危险因素。

rs2046210定位正在染色体6q25.1 ERS1上游，其编码的 ERS1蛋白通过与雌激素结合发挥雌激素代谢功能。过往研究显示该位点对乳腺癌具有强烈的预测作用[18]。罗力等研究发现rs2046210 TT基因型携带者可增加乳腺癌患病风险，为乳腺癌遗传易感性基因[19]。然而rs2046210基因多态性与URSA的关系还不清楚。本研究发现URSA组rs9340799位点各基因型比较有显著性，提示rs2046210位点多态性可能与URSA的发生相关。通过临床分析结果发现rs2046210基因多态性会影响URSA组血清E2、LH水平，logistic分析发现rs2046210 TT和TC基因携带者发生URSA风险的相对危险度分别为CC等位基因的1.354倍和1.824倍，提示rs2046210 T等位基因可能与URSA的遗传易感性相关，具有T等位基因的女性发生URSA的风险更高。

综上所述，ESR1 rs22234693多态性等位基因T、rs9340799等位基因G、rs2046210等位基因T突变会影响患者血清雌激素水平，增加女性发生URSA风险。因此ESR1基因多态性可能成为URSA发病机制以及治疗的重要依据之一，临床治疗前应先确定患者的基因型，不同基因型采取不同治疗方案。然而本研究仅对ESR1 rs22234693、rs9340799、rs2046210位点进行研究，且纳入病例数量不多，后续需要扩大样本量深入研究ESR1基因，为URSA发病机制、临床治疗提供更充分的理论依据。