新型超细晶铜材料植入大鼠子宫中Cu2+释放及对子宫组织的影响

暴 国 张长勇 饶 永 徐祥波 陈西华 郑玉峰 贺 斌*

1.国家卫生健康委科学技术研究所(北京，100081)；2.吴江永元生物科技有限公司；3.北京大学工学院材料与工程系

美国疾病控制与预防中心、世界卫生组织、FSRH、美国妇产科医师学会等重要组织机构认为放置宫内节育器(IUD)是适用于多种女性人群的安全避孕方法，近年来国外甚至推荐IUD作为一种紧急避孕方法[1]。尽管IUD被公认是可逆、高效的长效避孕方法，但仍存在不少临床问题。我国《12万例宫内节育器避孕效果调查报告》大样本研究显示，20年来，虽然IUD避孕有效率明显提高和品种大量增加，但出血、感染、腹痛、腰痛等副反应却没有下降。与20世纪80年代初期研究相比，有的副反应甚至升高[2]。已有研究显示Cu2+的暴释是副反应产生的重要因素之一[3]。2012年，郑玉峰等在未引入任何新元素和新材料情况下，通过多道次挤压方法制备新型超细晶铜材料，体外实验显示比普通铜具有更高的强度、更低的腐蚀速率，完全可接受的Cu2+释放行为以及更好的生物相容性[4]。在前期实验基础上，本研究以新型超细晶铜材料制备铜丝与现有IUD铜材料植入大鼠子宫，探究铜材料在动物体内的Cu2+释放及对子宫影响。

1 材料与方法

1.1 铜材料制备

普通铜材料由重庆南桐节育器厂(GCu200-20×22/日本铜丝，标称纯度99.99%)生产，铜丝直径0.4-00.04mm。新型超细晶纯铜材料由江苏吴江永元生物科技有限公司制备，标称纯度99.99%，铜丝直径0.3-00.03mm，制备方法按照郑玉峰的块体金属制备方法[4]，并在江苏苏州拉制成丝。两种铜材样品依次经过丙酮、无水乙醇及去离子水中超声波清洗，吹干。普通铜材料截取5.3 cm铜丝(59 mg，表面积(2πr2+2π·r·L=0.67 cm2)，新型超细晶铜材料截取7.1 cm铜丝(45 mg，表面积0.67 cm2)后，铜丝弯曲成螺旋管状备植入用。以TCu380 IUD用于体质量50 kg成年人核算，250 g大鼠应用铜面积约1.9 mm2[5]，植入一节铜丝螺旋管于1只250 g大鼠铜剂量为成年人的0.67 cm2/1.9 mm2=35.2倍。

1.2 实验动物

12周龄Wistar雌性大鼠60只(购于中国医学科学院实验动物中心)，体重200～250 g，按数字表法随机分为对照组和实验组各30只。饲养于本所实验动物中心，光照周期为明暗交替各12h，每天早8：00开灯，晚20：00关灯。环境温度21±1℃，相对湿度60%～80%，动物自由采食及饮水。实验研究遵循本所伦理委员会相关规定。

1.3 铜材料植入及取材

大鼠经2%戊巴比妥钠麻醉后，背部正中偏下方左侧切口入腹腔，找到左侧子宫后将子宫角轻拉出腹腔，距子宫角远端约1 cm处将子宫壁剪开一小口，将铜丝螺管置于大鼠左侧子宫腔内并用丝线固定于子宫壁，缝合子宫壁切口，逐层关闭腹腔，缝合背部切口，对照组植入普通铜材料，实验组植入超细晶铜材料；分别于术后12 h、1 d、3 d、7 d、15 d、30 d各处死5只大鼠。收集大鼠外周血血清，以1 ml生理盐水灌洗双侧子宫腔并收集灌洗宫腔液，收集双侧子宫组织，其中左侧与铜丝螺管接触区域及未植入的右侧子宫各取2段(3～4 mm)子宫组织、肝脏组织(0.25～0.40 g)，称重记录后分别保存于4%多聚甲醛和液氮中备用。

1.4 Cu2+浓度测定

采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP)检测大鼠血清、宫腔灌洗液、子宫组织、肝脏组织中的Cu2+浓度，检测前组织材料需消解的使用浓硝酸和去离子水消解：取全血200 μl，用1 ml硝酸+0.5 ml双氧水消解，去离子水定容到3 ml送检；取宫腔灌洗液300 μl，用1 ml硝酸+0.5 ml双氧水消解，去离子水定容到3 ml送检；肝脏组织(0.25～0.4 g)加入3 ml+1.5 ml硝酸消解，去离子水定容到30 ml，取3 ml送检。委托北京大学分析测试中心采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP)检测Cu2+浓度，并按照样品初始体积或质量换算成单位体积或质量浓度。

1.5 组织切片染色

固定于4%多聚甲醛中子宫组织常规脱水石蜡包埋，切片，常规脱蜡、水化，苏木素浸染1～2min后清洗，1%盐酸酒精分化5～10s，流水冲洗返蓝，伊红浸染20～30s，常规梯度脱水、透明、中性树胶封片，普通显微镜组织学观察。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 Cu2+在大鼠血清和肝脏中含量

植入两种铜材料后，两组大鼠血清中Cu2+浓度逐渐增加，在植入后3d达到高峰(P<0.05)，植入7d和15d时没有显著波动，至植入30d显著下降(P<0.05)接近植入12h时水平；实验组植入7d时血清Cu2+浓度呈下降趋势，至植入15d时低于对照组(P<0.05)。对照组各时点肝脏中Cu2+浓度未有明显波动，实验组植入7d、15d和30d时Cu2+浓度均低于植入3d时(P<0.05)。见表1。

表1 两组埋置铜丝不同时间Cu2+浓度比较

2.2 Cu2+在大鼠子宫腔灌洗液中含量

两组放置铜丝螺管的左侧子宫宫腔灌洗液Cu2+浓度呈相似变化趋势，植入12h、1d时Cu2+浓度无明显变化，植入3d时达高峰(P<0.05)，植入7d、15d、30d时逐渐下降，且实验组植入3d、7d、15d时低于对照组(P<0.01。右侧宫腔灌洗液Cu2+浓度低于左侧，且在植入12h、1d、3d时逐渐升高，至7d后Cu2+浓度趋于稳定。见表2。

表2 两组埋置铜丝后不同时间宫腔液中Cu2+浓度比较

2.3 Cu2+在大鼠子宫组织中含量

在植入12h，两组植入铜丝的左侧子宫组织中Cu2+浓度无差异，植入1d、3d时下降，在植入7d、15d时实验组低于对照组(P<0.05)。未植入铜材料的右侧子宫组织中Cu2+浓度较左侧低，且在植入7d、15d时实验组低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组埋置铜丝后子宫组织中Cu2+浓度比较

2.4 子宫组织形态学结果

组织学结果显示，埋植铜丝1d，对照组子宫宫腔上皮广泛脱落，腔上皮下的基质细胞裸露，宫腔内可见炎性渗出物及坏死脱落组织，内膜中有大量的炎性细胞侵润，内膜无菌性炎症反应累及范围广而深，达到内膜中部，并部分累及到腺体；实验组子宫虽同样可见子宫内膜腔上皮脱落，腔上皮下的基质细胞裸露以及无菌性炎症反应，但炎性反应仅局限于内膜浅层，并未像对照组炎症反应已经到达子宫深层。在埋植铜丝7d，两组子宫组织宫腔上皮仍有部分脱落，腔上皮下的基质细胞呈现部分裸露，炎性反应发生在内膜浅层，但对照组更为明显。在埋植铜丝30d时，两组无明显区别，内膜上皮被覆基本完整，内膜浅层可见少量的炎性细胞侵润，呈现慢性炎症反应。见图1。

图1 不同植入组大鼠各时期子宫组织学表现

3 讨论

尽管临床实践证明含铜IUD具有较理想的避孕效果，但出血、感染、腹痛、腰痛等不良反应始终困扰着使用者。Cu2+暴释是副反应产生的重要因素之一，Cu2+暴释与铜材料的腐蚀行为密切相关[6]，而块体铜材料不同的内部组织结构是造成腐蚀行为差异的原因。普通纯铜材料内部的晶粒平均尺寸为40μm，表面晶界密度较低；而本研究实验组采用的新型超细晶铜材料的平均晶粒尺寸仅为0.3 μm，表面晶界密度和缺陷密度大幅增加，高密度晶界可以降低铜在模拟体液中的腐蚀速率。体外研究也显示了超细晶铜材料具备完全可接受的Cu2+释放行为以及更好的生物相容性[4]。

本研究中植入不同铜材料的两组大鼠外周血和肝脏组织中Cu2+浓度变化趋势未见差异，提示超细晶铜材料植入大鼠宫腔后释放的Cu2+对机体系统性影响与普通铜材料相似。同时，宫腔灌洗液中的Cu2+浓度两种铜材料在植入3d时达到高峰，随后开始下降，但超细晶铜材料组下降更明显且低于普通铜材料组，提示两种铜材料的早期爆释峰值时间相似，但超细晶铜材料的Cu2+爆释持续时间更短，爆释量更低。

大鼠植入侧子宫组织中Cu2+浓度检测结果显示，尽管在两种铜材料植入后前3天没有差异，但在7d和15d时超细晶铜材料组降低明显，植入30d时两种含量相似。组织学观察，在两种铜材料植入后早期两组子宫内膜均经历急性炎性损伤，超细晶铜材料组在植入7d时内膜组织表现出更好的组织修复，至植入30d两组组织学相似，呈慢性炎症改变。提示超细晶铜材料可能有利于减少子宫出血包括出血量和出血时间。

当前国内外为解决含铜IUD的不良反应开展了多方面研究工作，如减少铜的暴露面积，采用铜管或钢丝套管包绕铜线[7]。蔡水洲等研究出纳米铜与低密度聚乙烯的新型纳米复合材料来改善Cu2+暴释现象，提高铜离子利用率[8]。Li Juan等提出了一种铜盐与二氧化硅和聚乙烯醇的新型复合材料，消除了植入初期的暴释[9]。由于这些研究引入了新元素或新材料，也有许多未知问题需要深入研究解决。新型超细晶铜材料制备工艺主要是通过多道次挤压工艺改变材料晶格尺度[10]，并没有引入新的元素或材料。本研究结果提示与传统普通铜材料相比，可以降低早期Cu2+释放峰值，缩短爆释时间，有效缓解了Cu2+暴释问题，进而减少和缓解由于Cu2+暴释引起的子宫损伤等不良反应。有望能替代现有含铜IUD中的普通铜材料，以减少临床应用中含铜IUD出血等不良反应。