血清、尿液中miRNA-150及miRNA-30a-5P对儿童特发性肾病综合征的诊断价值

师钟睿，李伟鑫，张明华

肾病综合征是指因肾小球滤过膜受损而导致机体内大量蛋白质从尿液中丢失的临床综合征,可分为特发性和继发性两种[1，2]，具体发病机制至今不详。特发性肾病综合征(idiopathic nephrotic syndrome，INS)是肾病综合征临床诊断的常见类型[3]。一旦诊断及治疗不及时，严重影响患儿的生存状态[4]。病理学诊断是目前INS的金标准[5]，但有创操作、患儿不便配合和穿取位置等原因严重影响连续监测。研究表明，miRNA与多种疾病的发生、发展密切相关[6-8]，包括特发性肾病在内的多种疾病的发生均可导致miRNA的表达紊乱[9，10]。已有研究发现，肾病综合征患儿血清 miRNA的表达水平与健康儿童对照组差异明显，而且miRNA-150及miRNA-30a-5P在INS的发生过程中具有重要作用[11-13]。因此，本研究拟通过检测miRNA-150及miRNA-30a-5P在肾病综合征患儿血清及尿液中的表达水平，旨在为临床诊断提供更加便捷的途径。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2017-01至2019-12武警特色医学中心肾内科确诊的93例INS患儿作为患儿组，其中男72例，女21例，年龄3～14岁，平均(7.5±4.2)岁。所有患儿均符合全国肾病学会制订的特发性肾病的诊断标准(24 h 尿蛋白>50 mg/kg) ，且入院前未经任何治疗。排除标准：(1)先天性或继发性肾病综合征；(2)其他肾脏疾病及尿路异常或感染；(3)其他免疫疾病、肝脏及心血管疾病。入院确诊后接受激素和其他常规辅助治疗，包括降压药、利尿药等，部分使用环孢素、环磷酰胺、他克莫司及麦考酚吗乙酯等。另选取同期在本院常规体检的儿童89例为对照组，女20例，男69例，年龄3～14岁，平均(7.2±3.9) 岁，各项检查指标均正常。两组性别、年龄差异无统计学意义，具有可比性。所有入选者法定监护人均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准通过。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器及试剂 LightCycler96实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司);1612-1高速离心机(上海医疗器械集团有限公司); 日立 7600型全自动生化分析仪。Trizol试剂(美国Life Technologies公司)；氯仿、异丙醇 (上海化学试剂有限公司)； miRNA-150及miRNA-30a-5P探针(美国Applied Biosystem 公司)；RT-PCR反应体系中的其他试剂及反转录反应体系中的试剂(大连Takara公司)。

1.2.2 标本收集与处理 两组患儿均取空腹静脉血3.5 ml和晨尿8 ml。血和尿样于室温3000 r/min离心, 10 min。离心后每份血清和尿液标本留取小部分于-80 ℃保存，用于检测miRNA- 150及miRNA-30a-5P水平。

1.2.3 血清RNA提取 制无菌DEPC处理水，标本常温下溶解；加入0.2倍体积(200 μl )的三氯甲烷振荡，室温静置3～5 min,15 000 r/min，离心15 min。取上层液相，加入等体积的异丙醇，-20 ℃静置12 h。15 000 r/min，低温离心25 min，去上清，沉淀中加入1 ml 75%乙醇，仪器震荡。15 000 r/min，低温离心5 min，去上清。

1.2.4 尿液RNA提取 将尿液标本在4 ℃、4000 r/min离心25 min，取500 μl 上清液，根据试剂盒说明书加入100 μl ExoQuick 试剂，混匀离心后用 Trizol 法从新鲜尿液标本的外泌体中提取RNA，并溶于 20 μl去RNA酶水，冻存于-80 ℃待用。

1.2.5 qRT-PCR检测 采用反转录试剂盒合成cDNA。根据大连Takara公司Prime Script miRNAq PCR Starter Kit Ver 2.0说明书进行。U6基因作为内参基因。引物序列miRNA-150：5′-AGAGGGTTGGGAACATGGTCAC-3′;引物序列miRNA-30a-5P：5′-CACTCTCATGTAAACATCCTCGAC-3′;引物序列U6：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。反应条件为预变性95 ℃, 15 s，1个循环；PCR反应，95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，40个循环；熔解曲线分析，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，1个循环。运用qRT-PCR技术检测血浆标本中miRNA的相对表达值，每个标本进行3次检测，取其平均值，以U6为内参，结果采用2-ΔΔCt计算。

1.2.6 尿蛋白和血清学指标测定 采用干化学法测定尿常规尿蛋白；采用双缩脲法测定 24 h 尿蛋白；血清 Alb、TP、TC、TG、尿酸、尿素和肌酐采用日立 7600型全自动生化分析仪进行定量检测。

2 结 果

2.1 生化指标水平比较 患儿组与对照组血清尿素、肌酐及尿酸水平基本一致，差异无统计学意义。但患儿组蛋白尿、总胆固醇、三酰甘油及尿酸水平显著高于对照组，而总蛋白和清蛋白含量明显低于对照组，差异均具有统计学意义(P< 0.05，表1)。

表1 特发性肾病综合征患儿组及对照组生化指标水平比较

2.2 血清和尿液中miRNA- 150及miRNA-30a-5P检测结果比较 患儿组与对照组在尿液中miRNA-150水平基本一致，差异无统计学意义。但患儿组血清和尿液中miRNA-30a-5P及血清中miRNA-150水平显著高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。且患儿组经治疗后病情缓解或控制的46例患儿中，血清和尿液中miRNA-30a-5P及血清中miRNA-150水平显著下降，与之前的水平相比，差异具有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 特发性肾病综合征患儿组及对照组血清和尿液中miRNA-150及miRNA-30a-5P水平比较

2.3 ROC曲线分析(图1) 患儿血清中miRNA-150和miRNA-30a-5P诊断INS的ROC曲线下面积(AUC) 分别为0.852(95%CI: 0.812～0.892)、0.869(95%CI: 0.901～0.837)；患儿尿液中miRNA-150和miRNA-30a-5P诊断INS的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.825(95%CI: 0.783～0.867)、0.833(95%CI:0.804～0.862)。

图1 特发性肾病综合征患儿血液及尿液中miRNA-150和 miRNA-30a-5P ROC曲线A.血清中miRNA-150；B.血清中miRNA-30a-5P；C.尿液中miRNA-150；D.尿液中miRNA-150

3 讨 论

目前，INS由于病因及病理类型不同，加之缺乏准确的分子水平诊断及监控特异性无创性分子标志物，病理形态学仍是其诊断的金标准[14]。近年来，随着分子学的不断发展，人们发现一些新型生物标志物可作为无创性的分子标志物提示INS的发生及发展。miRNA作为生物标志物，可能成为INS诊断治疗及判断预后的重要标志物[15]。有研究发现， miRNA-30a-5p 和 miRNA-30 家族其他成员在肾病患者足细胞中下调，促进足细胞损伤，并进一步证实 miRNA-30 通过靶向作用于 Notch1 和 p53保护足细胞[16]。同时有学者认为，肾小球损伤的成人肾组织中一些特定miRNA表达失调[17]。miRNA-150的基因位点在人体染色体19q13.33，通过调控靶基因引起下游基因的表达发生变化。南京军区总医院课题组研究发现，肾病综合征患儿血清miRNA-150的表达水平明显高于健康人[18]。

本研究结果发现，患儿组血清及尿液中miRNA-30a-5P及血清中miRNA-150水平明显高于对照组，尿液中miRNA-150水平基本一致。经临床治疗后，其中46例病情控制或缓解的患儿血清及尿液中miRNA-30a-5P及血清中miRNA-150水平显著降低。说明患儿血清中miRNA-150及miRNA-30a-5P可能与INS存在某种内在联系。通过miRNA-150和miRNA-30a-5P诊断INS的ROC曲线下面积，本研究结果发现，血清和尿液中miRNA-150及miRNA-30a-5P水平可在一定程度上反映INS的存在，但对于其发生及发展过程乃至愈后的判断是否有预测作用，因本实验的设备及相关观察的限制，未能进行相关的研究，我们将在以后的研究中进行观察。对于miRNA-150及miRNA-30a-5P在INS患儿肾组织中的表达量是否有变化以及变化方式如何，目前尚无文献报道。从本研究的患儿血循环和尿液的检测结果推测，miRNA-150及miRNA-30a-5P在患儿肾组织中的表达会有一定的变化。

综上所述，INS患儿血清及尿液中miRNA-150及miRNA-30a-5P含量明显升高，经治疗后水平显著降低，可能作为辅助诊断INS的良好分子标志物。下一步将针对诊断、治疗及预后评估进行更深入地研究。