细叶韭花醇提物化学成分及抑菌作用研究

李美萍，刘燕，张生万，郭彩霞，尉立刚

(山西大学 生命科学学院，太原 030006)

细叶韭(AlliumtenuissimumL.)属于百合科葱属多年生草本植物。其顶端花序细叶韭花(AlliumtenuissimumL. flowers，ATFs)，又被称为麻麻花、摘麻花等，是北方地区传统的调味品[1]，其伞形花序呈半球状至球状，较为松散，花为白色至浅紫色，花期主要在7～9月份[2]。将其自然风干、油炸之后，香味独特，深受人们喜爱。细叶韭花中含有蛋白质、氨基酸、还原糖等营养物质[3]。此外，细叶韭花也是一种新型的药食同源调味品，具有软化血管、降血糖、降血脂等功效[4]。

近年来，人们对葱属植物的研究主要集中在对大蒜、洋葱、大葱的研究。Ebrahimzadeh等[5]发现大蒜具有自由基清除能力和抗溶血功效。马利华等[6]比较了不同预处理后大蒜的品质和抗氧化性。刘兰等[7]利用高效液相色谱法对大蒜愈伤组织中的二烯丙基二硫进行了分析检测。Simin等[8]发现洋葱中的多酚类物质能够有效清除自由基且具有抗炎效果。权美平[9]对洋葱挥发油的成分及生物活性进行了研究。李莎莉等[10]对洋葱生物活性及其在食品中的应用进行了研究。Sung等[11]发现大葱提取物能够有效降低肥胖小鼠的体重，并能减少脂肪积累；李肖等[12]对大葱的生物活性及化学成分做了详尽论述。而对细叶韭的研究主要集中在生物学特性、栽培技术、挥发性成分分析及精油提取等方面[13-16]，对细叶韭花醇提物的化学成分及抑菌作用的研究很少涉及。赵国萍等[17]认为香辛料类物质抗菌谱广，采用酒精为溶剂的香辛料提取物对多种细菌均有强烈的抑制作用。因此，本实验采用乙醇作为溶剂，提取细叶韭花中的有效成分，利用高效液相色谱法测定细叶韭花醇提物的化学成分及含量；采用牛津杯法抑菌实验测定提取物对枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌效果，以期找到最适的细叶韭花有效成分提取方法，为细叶韭花的开发利用提供实验参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 菌种

大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)：由山西大学微生物实验室提供。

1.1.2 培养基

细菌基础培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、pH 7.2～7.4。

1.1.3 材料与试剂

细叶韭：购自山西省朔州市。乙腈(色谱纯)：Merck KGaA公司；娃哈哈纯净水；紫云英苷：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

BS124S分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；高效液相色谱仪 美国Waters公司；LS-75HD立式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司；生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超净工作台 上海茸研仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 细叶韭花醇提液制备

称取粉碎并过80目筛的细叶韭花粉末10 g于250 mL的具塞锥形瓶中，按料液比1∶15加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在40 ℃下浸泡30 min后经减压抽滤，得到的滤渣再次进行提取，合并两次滤液，于旋转蒸发仪中浓缩成浸膏。用30%的乙醇溶解得到细叶韭花醇提液。

2.2 高效液相色谱条件

色谱柱为Agela Venusil XBP-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agela公司)，柱温35 ℃，流动相A为乙腈，流动相B为水；流速0.8 mL/min；进样量20 μL，检测波长260 nm。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 The gradient elution procedure of mobile phase

2.3 紫云英苷含量测定

精密称取紫云英苷标准品0.0100 g，配制成100 μg/mL的母液；然后依次稀释到10，20，30，40，50，60 μg/mL；按照2.2项下色谱条件进样测定，以紫云英苷的质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线为y=63925.065x-560255.49，R2=0.9985。

2.4 菌悬液制备

取无菌水15 mL加入到培养24 h的枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌及金黄色葡萄球菌培养基中，用灭菌的涂布器将菌液混匀，备用。

2.5 抑菌圈的测定

采用牛津杯法测定抑菌圈直径。取灭菌、冷却到45 ℃左右的细菌基础培养基15 mL，倒入已灭菌的平皿中，待冷却凝固后，将制备好的枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌及金黄色葡萄球菌菌液分别取100 μL用涂布器涂布均匀。将灭菌的牛津杯在酒精灯上迅速灼烧后立即放置在涂菌后的平皿培养基上，轻轻按压使其与培养基之间没有空隙，分别向牛津杯中加入细叶韭花乙醇提取液0.1 mL，将平皿置于37 ℃培养箱中培养24 h；对照组使用30%的乙醇溶液。测量抑菌圈直径，取平均值，每株菌做3次重复。牛津杯实验结果的判定标准[18]：抑菌圈直径>20 mm，极敏；16～20 mm，高敏；11～15 mm，中敏；8～10 mm，低敏；<8 mm，不敏感。

2.6 MIC、MBC的测定

依据文献[19]并稍作修改。将灭菌的试管依次编号并加入细菌基础培养基1 mL，向1号管中加入细叶韭花提取液1 mL，混匀，取1 mL至2号管中，依次到第5号管，弃去最后1 mL，然后向试管中加入1 mL菌液。第6号管只加菌液不加提取液作为阳性对照，第7号管只加细菌基础培养基作为阴性对照，分别测定不同提取液对大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑制浓度。于37 ℃培养24 h，观测结果。当阳性对照浑浊，阴性对照透明，实验组肉眼观察无菌生长，无菌生长的最高稀释浓度即为该提取液的MIC。从无菌生长的试管中吸取0.1 mL接种到普通培养基上，37 ℃培养24 h，菌落数少于5个视为无细菌生存，以无菌生长的最小浓度作为该提取物的MBC。为减少误差，重复3次，取两次结果相近的值作为最终值。

3 结果与讨论

3.1 细叶韭花醇提物的高效液相色谱图

在2.2的色谱条件下，得到提取物样品和紫云英苷标准品的液相色谱图，见图1。

图1 样品与紫云英苷标品的色谱图Fig.1 Chromatogram of sample and astragalin

由图1可知，在给定的色谱条件下细叶韭花醇提物得到了很好的分离，且主要有效成分与紫云英苷标品出峰时间一致，认为紫云英苷是细叶韭花醇提物的主要化学成分。同时按2.3项所建立的紫云英苷标准曲线方程计算乙醇提取物中紫云英苷含量，得到60%乙醇提取物的紫云英苷含量最高，达到9.67 μg/mg，结果见图2。

图2 不同浓度乙醇提取物中紫云英苷的含量Fig.2 Content of astragalin in different concentration of ethanol extracts

3.2 不同醇提物的抑菌实验结果

3.2.1 不同浓度的乙醇提取物对3种菌的抑制作用

实验考察了30，40，50，60，70 mg/mL的浓度梯度下乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌性能，结果见表2。

表2 乙醇提取物对3种菌的抑制作用Table 2 Inhibition of ethanol extracts on the three kinds of bacteria

续 表

由表2可知，3种菌对细叶韭花醇提物显示出不同的敏感程度，这与微生物的菌株和醇提物的浓度有关。对于3种细菌，提取物浓度在30 mg/mL时，60%、70%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌为中敏，且60%乙醇提取物的抑制效果最强，达到12.08 mm；其余提取物对3种菌均为低敏。当提取物浓度为40 mg/mL时，除80%、90%的醇提物外，其余提取物对金黄色葡萄球菌均为中敏；60%乙醇提取物对大肠埃希氏杆菌为中敏，其余提取物对枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌均为低敏。当提取物浓度为50 mg/mL时，60%乙醇提取物对3种菌均为中敏，其余提取物对3种菌为中敏和低敏。当提取物浓度为60 mg/mL时，提取物对金黄色葡萄球菌均为中敏。当提取物浓度为70 mg/mL时，60%醇提物对金黄色葡萄球菌为高敏，抑菌圈达到16.03 mm；除90%醇提物对枯草芽孢杆菌抑菌、大肠埃希氏杆菌均为低敏外，其余提取物对3种菌均为中敏。

3.2.2 不同浓度60%醇提物的抑菌实验

实验考察了30，40，50，60，70 mg/mL的浓度梯度下60%乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌性能，结果见图3。

图3 不同浓度60%醇提物对3种菌的抑制作用Fig.3 Inhibition of different concentration of 60% ethanol extracts on the three kinds of bacteria

由图3可知，细叶韭花60%乙醇提取物对3种菌的抑制效果随着提取物浓度增大呈增加趋势，且对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显大于枯草芽孢杆菌与大肠埃希氏杆菌。当60%醇提物的浓度为50 mg/mL时，对大肠埃希氏杆菌与枯草芽孢杆菌的抑制效果相当，之后，随着浓度的增大，提取物对枯草芽孢杆菌的抑制作用超过了对大肠埃希氏杆菌的抑制作用。

3.2.3 MIC、MBC实验结果

60%乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌及金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别见表3和表4。

表3 细叶韭花60%乙醇提取物的MICTable 3 MIC of 60% ethanol extracts from ATFs

表4 细叶韭花60%乙醇提取物的MBCTable 4 MBC of 60% ethanol extracts from ATFs

由表3可知，细叶韭花60%乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏杆菌的MIC分别是35，17.5，35 mg/mL。

由表4可知，细叶韭花60%乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏杆菌的MBC分别是35，17.5，35 mg/mL。

4 结论

采用乙醇作溶剂提取细叶韭花，通过高效液相色谱分析细叶韭花醇提物的化学成分，可知细叶韭花醇提物中主要含有紫云英苷，且60%乙醇提取物中的紫云英苷含量最高；紫云英苷化学名为山奈酚-3-葡萄糖苷，是广泛存在于药用植物中的一种天然类黄酮化合物，具有显著的抗炎、抗氧化、抗过敏、抗菌等作用[20]。

细叶韭花不同浓度乙醇提取液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、枯草芽孢杆菌均有抑制效果，且随着细叶韭花乙醇提取物浓度的增大，抑菌效果逐渐增强，尤以60%醇提物对上述3种菌的抑制效果最强，且对金黄色葡萄球菌的抑制作用大于对枯草芽孢杆菌与大肠埃希氏杆菌的抑制作用。由此可以推断，细叶韭花醇提物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、枯草芽孢杆菌起抑制作用的主要成分可能是醇提物中的紫云英苷，这一推断与文献[20]报道的紫云英苷的功效一致。