儿童专科医院样本库的生物样本特征分析及策略建议

王新杰，王敏，黄楚天，周君梅

·生物样本库建设·

儿童专科医院样本库的生物样本特征分析及策略建议

王新杰，王敏，黄楚天，周君梅

200040 上海交通大学附属儿童医院/上海市儿童医院生物样本库（王新杰、王敏、黄楚天、周君梅）；200127 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心血液肿瘤科（王敏）

生物样本库为转化研究提供重要的研究资源[1]，其通过与疾病特征和研究目的相关联的顶层设计、系统规范地收集健康个体来源的和疾病个体来源的血液、组织、各种体液等样本，经过与样本特性相适宜的处理后再将样本冷冻保存[2]。生物样本库的规范建设和科学管理至关重要，对各种样本分析前变量开展质控研究以建立科学的样本处理和存储方案、从而最终为转化研究提供高质量的样本，越来越引起了研究者的重视[3-5]，也有望为解决研究结果的可重复性和可靠性提供思路[6]。传统的生物样本库以采集和存储各种生物大分子、体液、组织等不可再生的类型的样本为主，随着近年来对生物样本库“活库”的重视，样本库的规划与发展也迎来了新的挑战，“活库”以其独特优势有望成为未来下一代样本库的发展重点[7-8]。

近十年，各医疗机构和科研团体建立了各种主题的生物样本库。儿童专科医院具有独特的疾病种类，基于儿童疾病建立的生物样本库也具有独特的样本类型及其特征，对其进行深度分析，有助于明确现行存在的问题，从而及时调整样本库运行策略、为临床提供更有力的资源平台支撑。

1 样本库的运行、管理和数据分析

1.1 组织架构与运行流程

我院样本库的组织架构遵照常规样本库的管理模式[9]，包含软件系统与硬件设施。软件系统包括样本库的专职管理团队、科室规章制度、样本库的信息管理系统等；硬件设施方面，样本库根据功能划分为样本接收区、样本处理和质控区、样本存储区、信息管理区和库房等几大功能区。样本库的运行流程包括立项、采集、处理、质控及入库等。样本库的日常运行及样本出入库流程受医院的学术委员会和伦理委员会的管理与审核。

1.2 入库管理及质控

我院采用“一病一卡”的管理制度，在入库环节进行源头质控[10]，根据疾病的诊疗特点和可能的研究需求确定疾病特异性的样本采集计划后遵照执行。临床工作人员采集样本后运送至样本库，由样本库专职人员进行样本分装、二维码标签粘贴、信息录入、样本入库等操作。在存储过程中，样本信息及存储位置由两名工作人员共同核对确认，以保证信息的准确性。定期对在库样本进行质量自检及送第三方质控，定期参与室间比对，以确保质控体系的可靠，保证样本的全流程质控管理[11]。

1.3 数据管理及分析

样本库信息系统可自动定期对样本库数据进行统计和备份，同时，样本库管理人员也定期对入库数据进行记录、统计与分析。本次数据整理范围为 2015 年 1 月 1 日 – 2019 年 7 月 1 日我院样本库入库的样本，间隔时间为半年，对各时间节点的样本特征进行分析。

1.3.1 入库样本量及样本类型变化分析 对每个时间节点的样本总数和病例数进行统计，以时间为横坐标绘制折线图，反映两者的变化趋势；对数据统计始末的在库样本按照样本类型进行分类，统计各类型样本数，绘制饼图展示各类型所占比例。

1.3.2 入库样本病种变化分析 将在库样本的疾病种类分为出生缺陷、儿童肿瘤、免疫异常、感染性疾病、代谢性疾病及其他等六大类别，在每个时间节点统计各疾病类别的样本量及各自占比，以时间为横坐标绘制堆积柱形图，反映其变化趋势；鉴于我院儿童专科医院的特色，病种以出生缺陷为主，故进一步将出生缺陷类疾病分为结构畸形、功能缺陷、遗传物质异常三类，绘制堆积柱形图反映各自变化趋势。

1.3.3 项目库与战略库的变化分析 根据样本入库前是否有项目支撑，将样本库中子库分为项目库与战略库，统计近 5 年项目库与战略库样本量及各自占比，以时间为横坐标绘制堆积柱形图反映其变化趋势。统计2015 年初与2019 年中项目库与战略库样本量及各自占比，分别以柱状图与饼图总结其各自的变化趋势。

2 儿童专科医院样本库样本特征分析结果

2.1 入库样本呈稳步增长趋势，样本类型仍以传统类型为主

自 2015 年年初 – 2019 年年中，样本库飞速发展，入库的样本总数及病例数均呈稳步增长的趋势（图 1A）。样本类型方面，各类型所占比例变化不大，仍以传统类型为主，其中全血样本占比最高，超过 50%，其次是 DNA 样本及组织样本，分别为 24.95% 及 10.82%。占比较少的其他类型样本包括尿液、粪便以及诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等，其中 iPSCs 为目前唯一一种活库样本（图 1B）。

图 1 样本总数及病例数的变化趋势（A）及各类型样本的占比（B）

图 2 疾病种类类型分析（A：病种特点；B：出生缺陷）

2.2 入库样本的病种分析结果呈现出儿童专科医院的特点

基于儿童专科医院特殊的疾病种类，样本库管理人员对来自多个临床科室的样本按照不同疾病类型进行分类统计。2015 年初，出生缺陷类疾病样本占总样本量的 40% 左右，为占比最大的疾病类型，病种无法明确归类的其他类型疾病次之，儿童肿瘤再次之，免疫异常相关疾病样本占比最少。自 2016 年年中起，感染性疾病样本开始出现，至 2017 年年初，又新增了代谢性疾病样本，但其余四种类型疾病的占比先后次序并无变化（图 2A）。其中，作为儿童专科医院特色病种，出生缺陷类疾病仍为占比最多的疾病类型，且样本量持续增长，因此，将该疾病类型进一步细化分析。与 2015 年年初相比，近年来新增了功能缺陷疾病的样本，原有结构畸形与遗传物质异常疾病的样本也持续增加，各类型占比变化不明显（图 2B）。

2.3 项目库与战略库均呈增长态势、但项目库占比明显提高

根据样本入库前是否有科研基金项目支撑，将样本库分为项目库与战略库两个子库。2019 年年中，项目库与战略库中的样本数量均较初期有所增加，其中项目库涨幅更大（图 3A）。两个子库所占比例变化明显，目前战略库子库的绝对数虽仍多于项目库，但其占比已从 2015 年年初的 78.57% 减少到了 2019 年年中的 52.17%，而项目库则从 2015 年年初的 21.43% 增加到了 2019 年年中的 47.83%（图3B）。

图 3 项目库与战略库的变化趋势（A）及构成比变化（B）

3 总结与展望

生物样本库为转化医学研究储备了极其重要的研究资源，因而，样本库的规范建设和科学管理极为重要，不仅体现在对在库样本的质量把关，更体现在样本库管理人员身为连接临床与基础的重要桥梁，需从宏观角度分析样本库的在库样本特征、及时向管理部门和临床科室反馈信息、根据在库样本特征及时调整样本管理策略和为临床科室提供咨询，从而更好地服务于临床研究和转化研究。本研究对儿童专科医院样本库近 5 年的样本特征进行了分析，其结果为未来调整样本库管理策略提供决策支持。

3.1 样本库是临床研究的资源平台支撑，项目库和战略库各有侧重

从动态数据分析结果来看，项目库和战略库在不同时期的占比不同。项目库子库是指样本在入库时研究目的明确、有科研项目支撑的样本子库；战略库子库是指样本在入库时研究目的尚不明确、尚无科研项目支撑，但基于对该疾病已有的知识和待解决的诊疗问题、未来有可能申请项目支持该样本的研究而战略性采集和保藏疾病样本建立的样本子库。在儿童专科医院，一些罕见病的样本常以战略库子库的形式采集和保存样本。在样本库运行的早期阶段，由于样本的重要性和如何科学地留取样本在各临床科室的认知度较低、对于如何利用样本开展研究也认识不充分，因此，此阶段的入库病种以战略库子库为主导地位。随着样本对于研究的重要性在各临床科室的认知度逐渐提升，后期样本库里的项目库子库占比不断提升。随着近年来对临床研究的重视，样本的采集和保藏计划也将纳入临床研究方案的规划，项目库子库有望为临床研究提供更好的资源管理平台。

临床研究是一项复杂的系统工程，其以患者为主要研究对象，对其疾病的诊断、治疗、预后、病因和预防措施等进行研究，其目的是解决临床中尚未解决的诊疗问题[12]。以往的临床研究过程中的疾病样本的管理及其质量尚有待重视，因为样本的质量与研究结果的可重复性密切相关[6,13]，而样本的质量问题不仅包括样本本身的生物学质量评估，还包括在临床研究设计之初的样本采集计划是否合理以及相关的临床诊疗和随访信息是否完整。新颁布的《中华人民共和国人类遗传资源管理条例》旨在支撑疾病样本的合理采集与规范使用，随着高质量临床研究项目的开展，采集和保藏高质量生物样本的项目库子库必将在未来的转化研究中发挥越来越重要的作用。

3.2 出生缺陷疾病样本是儿童专科医院的特色与重点，活库需要得到更多的关注

从分析结果来看，入库样本的病种以出生缺陷类为主。出生缺陷是环境与遗传相互作用所致，无论是否有明显的环境高危因素，基因是研究此类疾病的重点，如患儿的出生缺陷在其家族中有先证者，最好同时留取家系样本。高通量分析在寻找出生缺陷病因研究中发挥了重要作用，如果与出生缺陷高度相关的基因变异被发现，需要利用合适的动物模型或细胞模型进行功能实验，这种情况下，预先留取患儿的活细胞至关重要。

传统的样本库里存储的样本大多以生物大分子、组织、体液等不能在体外培养和扩增的类型为主，我院的样本也符合该特征。但由于这些样本不能用来开展功能实验，因此，近年来，生物样本库“活库”日渐受到重视[1,8]。顾名思义，“活库”的意思是样本可在体外合适的条件下存活和扩增，包括细菌和真菌等病原体、体细胞、类器官、患者来源的异种移植物等，其各有研究优势（表 1）。体细胞的优势在于对体外培养条件的要求较低、易于开展基因功能实验、细胞携带有患者的基因信息且能通过基因编辑建立较好的自身对照研究体系等。以本样本库的隐睾特异性 iPSCs 这一活细胞子库为例，其以隐睾患儿的尿源性细胞为种子细胞，导入与多能性密切相关的四个关键的转录因子、使其重编程为具有胚胎干细胞特性的 iPSCs，利用其体外向生殖细胞的诱导分化过程进行与隐睾导致不育相关的机制研究[14]。类器官是指在体外对组织进行原代团块样培养，保持其与体内类似的结构与细胞间连接，从而最大限度地在体外模拟其体内的生理状态用于研究[15]，来源于干细胞的类器官也可在体外动态培养中模拟体内发育过程。PDX 是肿瘤的个体化治疗的良好的实验模型，其将患者的小块新鲜肿瘤组织移植于人源化的免疫缺陷小鼠的皮下或肾包膜下，建立患者来源的个体化的肿瘤模型，在动物活体中较好地保存了患者原发肿瘤的遗传特性和异质性，具有独特优势[16]。我院样本库中儿童肿瘤的样本仅次于出生缺陷疾病的样本，但目前储存的形式多以肿瘤组织和 DNA 为主，在此基础上如能建立肿瘤组织来源的类器官或 PDX 模型，可为其将来的机制研究和个体化治疗储备宝贵资源。这些具有独特研究价值的活体样本是样本库未来的发展重点，然而，其对样本库的专业人员、硬件环境等要求较高，可能是当前尚未普及的重要原因之一，如能通过项目的支持和资源的调配，逐步建立来源于疾病个体的可再生的活体样本，意义深远。

表 1 常用的活体样本类型及其优势

3.3 根据儿童专科医院的样本特点，充分发挥样本库的支撑作用

从分析结果来看，我院生物样本库逐年稳步发展。随着管理体系的日渐成熟，我院样本库早已从最初的建设阶段进入了产出阶段。经统计，我院样本库迄今已经支持了多个级别课题的立项，分别来自国家自然科学基金、上海市科委、上海市教委、上海市卫健委、上海交通大学医学院等，并有多篇相关论著发表，内容涉及样本库的规范化管理与质量控制[10-11, 14, 17]以及多种疾病的相关临床研究。

基于儿童专科医院的特点，本文分析结果显示在库样本疾病种类以出生缺陷类疾病及儿童肿瘤为主，与之相符，样本库所支撑的相关临床研究亦聚焦于此，包括先天性巨结肠[18]、隐睾[19-20]等出生缺陷类疾病，神经母细胞瘤[21-22]等儿童肿瘤类疾病。此外，由于活库的建立可帮助临床研究者更全面地进行相关疾病的机制研究及推动个体化治疗，因此我院对样本库活库尤其是干细胞活库的应用也逐渐增加，并已有相关论著发表[19, 23]。未来我院生物样本库将在现有基础上，进一步完善管理体系，加强与临床资料的对接，以促进转化医学研究，尤其关注儿童专科医院特色病种，提升生物样本库对医院学科和人才的支撑作用。

综上所述，儿童专科医院的样本具有其独特性，样本库应及时有效地调整运行策略，以更好地支持临床研究，同时结合生命科学领域的进展，未来建立重要儿童疾病的活体样本库是必然的发展趋势。

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·协会之窗·

2020 年 5 月，协会受杭州师范大学委托，对其开展的“濒危珍稀中药铁皮石斛、霍山石斛人工繁育技术体系创建及产业化”项目进行科学技术成果评价。

为了顺利完成此次评价工作，协会在杭州师范大学提交了科技成果函审表及成果相关证明材料，包括工作报告，研究报告，技术报告，发表的论文、论著、专利等技术资料的基础上，组织相关领域专家组成评审专家组函审评价。

该项评价工作历时一个月。由陈凯先院士领衔的专家评审组，包含生物技术、中医中药和医药学等领域的院士和专家，向协会提交了上述成果的独立评价意见。在专家独立评价的基础上，陈凯先院士作为专家组组长，最终提交了函审综合意见、综合评分与评价结论。

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.004

上海市卫生健康委员会卫生行业临床研究专项（201940204）；上海交通大学转化医学协同创新中心合作研究项目（TM201827）；上海交通大学医学院转化医学创新基金（15ZH4008）

周君梅，Email：junmei_zhou@139.com

2019-12-16