儿童紫癜性肾炎舌苔生物样本库的建立与思考

庞爽，白晓红，王圣治，陈颖，赵诗语，李启英，张君

·生物样本库建设·

儿童紫癜性肾炎舌苔生物样本库的建立与思考

庞爽，白晓红，王圣治，陈颖，赵诗语，李启英，张君

200433 上海，复旦大学临床医学院（庞爽）；110033 沈阳，辽宁中医药大学附属医院儿科（白晓红、张君），肾内科（王圣治）； 200072 沈阳，辽北中医院儿科（陈颖）；110032 沈阳，辽宁中医药大学研究生学院（赵诗语、李启英）

过敏性紫癜（henoch-schönlein purpura，HSP）是好发于学龄期儿童的以坏死性小血管炎为主要病理改变的全身性疾病，主要表现为皮肤紫癜、关节肿痛、胃肠道出血等。紫癜性肾炎（henoch-schönlein purpura nephritis，HSPN）是继发于 HSP 的肾脏损害，是 HSP 最首要的致死原因[1]。在 HSP 首次发作后 4 ~ 6 周，约 40% 的患儿病情加重进展为 HSPN[2-3]。

舌诊是中医独特的诊断方法，尤其对“哑科”儿科而言，舌诊具有重要的临床意义。小儿口不能言，或虽能言但不足信，因此儿科诊法多以望诊为主，尤其是望舌，舌与五脏六腑之精气密切相关，能反映脏腑气血阴阳的生理病理变化，为儿科临床辨证论治不可缺少的客观依据。脱落细胞与菌群微生物是舌苔形成和变化的重要因素，两者相互作用，对舌苔上皮细胞的新陈代谢产生重要影响[4]。

近年来，国内外对舌苔的研究不断深入，得到了很多有意义的数据[5-9]，包括舌苔脱落细胞、舌苔微生态变化等重要数据信息，若在此基础上进一步研究，可节省大量时间和精力，然而面临两个问题：①有的研究原始数据信息（如患儿临床信息、舌苔微生态测序原始数据等）尚未完全公开；②一些特殊病例（如 HSPN 伴皮肤破溃、家族性 HSPN 等）由于未备份样本，即使数据完整，也无法再一次对原始样本进行深入研究。因此，本研究针对儿童紫癜性肾炎拟建立一个样本储存完善、数据收录完整的舌苔生物样本库，每一份舌苔样本对应完整的患儿临床信息、舌苔脱落细胞研究数据和舌苔微生态研究数据，使之成为一个“临床信息-舌苔样本-科研数据”资源共享的研究平台。研究者可利用平台的已有样本和数据信息，开展多中心舌苔临床课题、疾病发病机制、“中医-微生态学”舌诊现代化等相关深入研究（图 1）。

1 基础建设

1.1 人员配备

目前生物样本库现有专职研究员 2 人、专业技术员5 人，涉及检验、临床和细胞生物学等专业领域。全体生物样本库工作人员均经过标准化培训，对样本采集、运输、处理、储存、质控、出入库、回收等工作均能胜任，并定期进行标准化操作、设备安全操作等培训。

1.2 设施与环境

生物样本库位于医院科研楼四楼，总建筑面积约200 m2，由样本接受区、样本中心实验室、样本储存区、信息管理区和办公室五部分组成。样本储存区包括液氮储存室 1 间、超低温（–80 ℃）冰箱储存室 2间。样本库配备超低温冰箱、气相液氮罐、温湿度监控系统、生物安全柜、高速冷冻离心机、条码打印机、激光扫码枪、DNA 自动化抽提仪、实时荧光定量 PCR 仪、多功能酶标仪等相关设备，可完成对样本的初步处理和深度加工。同时配备双电路系统和超低温冰箱冷链监控系统，有专人定期对超低温冰箱进行维护和保养，以保证样本的质量安全。

1.3 信息系统

信息管理区使用海尔生物医疗开发的样本库信息化管理系统（biobank information management system，BIMS）对入库标本进行智能化管理，包括样本管理、样本源管理、容器管理、科研项目管理、权限管理等。其中样本管理包括样本编码、取材处理、储存记录、出入库记录、质量控制等信息；样本源管理包括知情同意书、患儿基本资料、体格检查信息、实验室检查结果、舌苔影像图片等信息；科研项目管理包括舌苔脱落细胞和舌苔微生态研究相关数据信息，以及出库样本的实验数据结果。系统可设置使用者权限，可查询操作痕迹，对所有数据均可自动化备份，从而保证信息系统的数据安全。

2 临床样本收集

2.1 签署知情同意

提交伦理申请，经医院伦理委员会审批合格后收集患儿舌苔样本，需告知患儿及其监护人相关事宜并签署知情同意书。知情同意书备份至 BIMS 生物样本库管理系统的样本源管理。

2.2 病例纳入

根据中华医学会儿科学分会制订的《紫癜性肾炎诊治循证指南（2016）》[10]，收集患儿病例，纳入标准：①符合西医 HSPN 诊断标准；②临床分型属孤立性血尿或孤立性蛋白尿、血尿和蛋白尿、急性肾炎型者；③年龄在 3 ~ 18 岁之间，包括 3 岁和 18 岁；④近 6 个月未使用任何抗生素、微生物制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等药物；⑤愿意配合并签署知情同意书。如以上纳入标准中有任何一项为“否”，则该患儿不能被纳入。

图 1 儿童紫癜性肾炎舌苔生物样本库研究平台

图 2 紫癜性肾炎患儿舌苔影像采集

排除标准：①紫癜性肾炎出现肾功能不全者；②紫癜性肾炎临床分型属于肾病综合征型、急进性肾小球肾炎型、慢性肾小球肾炎型；③合并有严重的呼吸、消化、血液、肝脏等原发性疾病或肿瘤、精神病、传染病患者。④年龄< 3 岁或年龄 > 18 岁；⑤近两周参加其他临床试验者；⑥未签署知情同意者；⑦不能配合舌苔采集者。如以上排除标准中有任何一项为“是”，则该患儿不能被纳入。

2.3 临床信息收集

由两名医务人员记录患儿一般情况、现病史、既往史、用药情况等，并记录体格检查（包括身高、体重、血压、呼吸次数、心率、心律、体温等）和实验室检查（包括尿常规、尿 β2微球蛋白、24 h 尿蛋白定量、血常规、血脂、血沉、免疫球蛋白、补体、肾脏彩超、肝功能、肾功能、心电图等）等相关数据。参照马融主编的十三五国家高等教育规划教材《中医儿科学》（新世纪第四版），对患儿舌象、脉象及中医证型进行判断并记录。以上信息由两名工作人员确认无误后，导入 BIMS 生物样本库管理系统的样本源管理。

2.4 舌苔影像采集

为排除染苔和饮食的影响，清晨患儿空腹状态下采集舌苔影像。采集前患儿用无菌 0.9% 氯化钠溶液漱口 3 次，取坐位张口伸舌，尽量暴露全舌于自然光线下，用高清摄像头（像素> 1000 万）拍摄图像（图 2），对图像标注名称，记录采集时间，与患儿临床信息一一对应，导入 BIMS 生物样本库管理系统的样本源管理。

2.5 舌苔样本收集

使用五点采样法收集舌苔样本用于微生态研究：①采集前患儿用无菌 0.9% 氯化钠溶液漱口 3 次，嘱患儿充分暴露全舌；②用口腔植绒采样拭子在患儿舌根、舌中部、舌两侧、舌尖来回刮拭 5 ~ 10 次；③采样后立即放入样品收集管内，及时封闭管口避免污染；④标记患儿编号及采集时间，每名患儿采样 5 份。

舌苔脱落细胞采样方法：①采集前患儿用无菌 0.9% 氯化钠溶液漱口 3 次，嘱患儿充分暴露全舌；②用一次性压舌板以中等力度从患儿舌中部轻轻刮取舌苔上浮物质，并立刻沿同一方向均匀涂在载玻片上；③迅速以 95% 酒精脱水固定以防止舌苔脱落细胞溶解或变形；④标记患儿编号及采集时间，每名患儿采样 5 份。

3 样本处理与保存

3.1 舌苔样本运输

由于温度对微生物影响较大，舌苔微生态样本需在采集后迅速放入便携式液氮罐中，舌苔脱落细胞样本则常温密封运输，由院内配送人员及时送至生物样本库的样本接受区。

3.2 舌苔样本处理与入库

样本从采集到处理应在 30 min 内完成。对于舌苔脱落细胞采用巴氏染色法，试剂由珠海贝索生物技术有限公司提供，操作过程严格按照产品所提供的使用说明书进行，最后用中性树胶封片固定。对于舌苔微生态样本，采用 Qiagen Mini 试剂盒提取舌苔微生物 DNA，并用统一冻存管分装备份，避免样本使用时反复冻融影响质量。所有样本通过中心实验室激光扫码枪及系统条码识别完成样本的入库和相关信息的导入，两种舌苔样本要分开储存，舌苔脱落细胞样本封片于 4 ℃常温保存，舌苔微生态样本于–80 ℃超低温冰箱保存。

3.3 舌苔样本质控

为保证儿童紫癜性肾炎舌苔生物样本库的样本质量，采用随机抽检的方法，每季度对库内样本进行质量控制。利用 NanoDrop2000 和琼脂糖凝胶电泳对样本 DNA 纯度、浓度和完整性进行检测（图 3），同时对舌苔样本的位置信息、临床信息、图像信息等正确性和完整性进行检查。对于投入使用的出库样本，样本库将第一时间获取研究者的使用反馈。

4 科研平台

4.1 舌苔脱落细胞研究

4.1.1 镜下观察 用低倍镜浏览全片，观察涂片背景、细胞着色、细胞叠压等情况，每张载玻片选取 5 个视野，要求每个视野在 100 倍显微镜下观察细胞数> 50 个。观察对象主要为角化前上皮细胞、不完全角化上皮细胞、完全角化上皮细胞。

运用电子显微镜成像系统，采集显微镜下细胞图像并记录脱落细胞分布情况。如图 4 所示，镜下上皮细胞核呈蓝紫色、核仁呈红色；角化前上皮细胞呈淡蓝色或淡绿色；不完全角化上皮细胞呈粉红色；完全角化上皮细胞呈橙色；红细胞呈鲜红色或橙红色；白细胞胞质呈淡蓝或淡绿色，核呈蓝紫色；黏液呈淡蓝或粉红色。将舌苔脱落细胞镜下成像图片导入 BIMS 生物样本库管理系统的科研项目管理，与系统中样本源管理的舌苔影像图片一一对接（图 5），为探索舌苔形成机制、舌苔变化与脱落细胞关系等相关研究提供准确的数据信息。

4.2 舌苔微生态研究

4.2.1 文库构建和测序 利用 Covaris M220 将舌苔微生态样本 DNA 片段化（约 300 bp），使用 TruSeqTMDNA Sample Prep 试剂盒通过磁珠法筛选去除接头自连片段，PCR 扩增进行文库模板富集，构建 PE 文库。使用 HiSeq 3000/4000 PE ClusteR Kit 将 DNA 扩增子线性化成单链，利用 Illumina HiSeq 平台进行测序[11-12]。

4.2.2 生信分析 对原始序列采用 Trimmomatic v0.38 进行数据优化处理，利用 Usearch v7.0 软件按照 97% 相似性进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类，对得到的 OTU 聚类结果进行注释及分类，得到各个分类水平上的物种组成分析、多样性分析、差异分析和功能预测分析等[13]（图 6）。将数据导入 BIMS 生物样本库管理系统的科研项目管理，研究者可根据舌苔微生态研究的统计分析数据，挖掘有效信息，寻找紫癜性肾炎患儿舌苔的特异性菌属[14]，开展舌象与舌苔微生态变化规律、“中医-微生态学”舌诊现代化、疾病发病机制等进一步深入研究，从菌群微生态的角度挖掘中医舌诊的科学内涵。

1 ~ 7：随机抽取的 7 个舌苔样本 DNA

图 4 舌苔脱落细胞显微镜下成像

图 5 舌苔脱落细胞图片导入BIMS 生物样本库管理系统

图 6 舌苔微生态生信分析

5 样本出库及回收

申请者可向样本库提交样本使用申请，经样本库委员会审批后可执行样本出库。在信息系统中的样本管理做好出库记录，包括样本出库日期、数量、申请者信息、用途和使用期限等。儿童紫癜性肾炎舌苔生物样本库为申请者提供舌苔样本、临床数据信息、舌苔脱落细胞数据和舌苔微生态生信分析数据。

申请者在一定期限内，执行样本返还工作，对质量合格的剩余样本可回收再次入库，提高样本利用率。同时申请者需提供相应的实验数据，一并收录到生物样本库中，实现样本库数据更新和资源共享。

6 讨论

6.1 舌苔生物样本库建设意义

生物样本库是医学研究的重要资源，能标准化收集、处理、储存样本，还可对样本进行质量控制、信息管理和数据共享[15]。近年来生物样本库建设在国内逐渐升温，体现了国家对生物样本库的高度重视。舌诊是儿科中医诊断不可或缺的重要部分，由于小儿无法准确描述病情，察舌辨证就显得尤为重要，通过观察舌苔的变化，可判断病邪性质、病位深浅和邪正盛衰，进而指导儿科临床用药。

脱落细胞和微生态是舌苔研究中最基础也是最重要的环节。舌苔生物样本库为研究者提供样本的同时，共享样本临床信息、脱落细胞研究数据和微生态研究数据，既为研究人员提供规范化的高质量样本，又给予基础研究的数据支持，最大程度上节省研究人员的时间和精力，同时对出库样本的实验数据备份，使数据不断扩充和更新，生物样本库得以可持续性发展。这对中医药学和生命科学等多学科交叉研究的开展以及提高我院承担国家重大科研项目的能力具有深远意义。

6.2 样本采集过程中遇到的困难和解决方案

儿童属于特殊群体，在样本采集初期遇到的困难有：①儿童生长发育尚未成熟，舌苔质薄，样本量少；②儿童心理发育尚未成熟，采样易产生恐惧，配合度差；③临床医师对样本的标准化采集不够了解，样本质量参差不齐。针对儿童采样问题，我们通过不断改进文案，力求表述简明且生动，并采取模拟演示、礼物奖励等方法，消除患儿恐惧心理。对专业人员进行规范化采样培训，最大程度上减少采样次数，增加对患儿的人文关爱。采用“五点取样法”在患儿舌根、舌中部、舌两侧、舌尖尽可能多地采集舌苔样本。在样本处理环节不断改进技术，提高 DNA 提取的浓度和纯度。针对临床医师操作问题，指定专业人员在科室进行一对一指导，鼓励医护人员免费使用生物样本，并提供相关科研咨询，有力地提升了科室留取样本的积极性和规范性。

6.3 舌苔生物样本库的应用

关于舌苔的研究，已经深入到细胞和分子水平，既往研究显示，脱落细胞和菌群不仅影响苔色和苔质，还可能参与某些疾病的发病机制[16-20]，因此舌苔的研究具有重要意义。对于儿童紫癜性肾炎舌苔样本库来说，其最大的特色是完整的配套数据，综合性的数据信息可以帮助研究者更好地掌握研究对象的特性和功能。研究者可直接利用生物样本库提供的数据对不同类型舌苔进行分类比较等基础研究，还可根据配套数据（如微生态生信分析等）进行分子机制探讨等深入研究，可有效减少重复性研究对样本的浪费，将宝贵的儿童样本投入到更深层次的研究中。为多中心舌苔临床研究、疾病发病机制、“中医-微生态学”舌诊现代化研究等多学科交叉的科研课题提供高质量的样本和共享数据，为科学研究带来最大程度的帮助。

综上，生物样本库建设的最终目的是服务于科学研究，其不单单是存储的样本库，更应是数据资源共享的样本库。本文拟建立儿童紫癜性肾炎舌苔生物样本库研究平台，以临床信息和舌苔样本为核心，整合脱落细胞和微生态研究数据，为临床、科研、教学提供高质量样本的同时，将生物样本库打造成可持续性发展的资源共享平台。

[1] Kawasaki Y, Ono A, Ohara S, et al. Henoch-Schönlein purpura nephritis in childhood: pathogenesis, prognostic factors and treatment. Fukushima J Med Sci, 2013, 59(1):15-26.

[2] Saulsbury FT. Clinical update: Henoch-Schönlein purpura. Lancet, 2007, 369(9566):976-978.

[3] Sano H, Izumida M, Shimizu H, et al. Risk factors of renal involvement and significant proteinuria in Henoch-Schönlein purpura. Eur J Ped, 2002, 161(4):196-201.

[4] Li X, Zhang JF, Yang YP. Primary discussion of association of microecology and tongue coating. Liaoning J Traditional Chin Med, 2014, 41(6):1102-1106. (in Chinese)

李响, 张军峰, 杨亚平. 舌苔形成的微生态学机制探讨. 辽宁中医杂志, 2014, 41(6):1102-1106.

[5] Zhou XF, Li X, Li FF. Study on tongue diagnose information of chronic renal failure with dampness-turbid sydnrome. Chin Arch Traditional Chin Med, 2018, 36(9):2146-2148. (in Chinese)

周小芳, 李雪, 李福凤. 慢性肾衰虚兼湿浊证的舌象特征研究. 中华中医药学刊, 2018, 36(9):2146-2148.

[6] Wang ZW, Bao K, Lin WQ, et al. Analysis on tongue coating, the tubulointerstitial lesions and clinical characters in 376 cases with ldiopathic membranous nephropathy. Guiding J Traditional Chin Med Pharmacol, 2018, 24(19):48-52, 59. (in Chinese)

王志伟, 包崑, 林文秋, 等. 376例特发性膜性肾病患者舌苔、肾小管间质损伤与临床分析. 中医药导报, 2018, 24(19):48-52, 59.

[7] Pieralisi N, de Souza Bonfim-Mendonça P, Negri M, et al. Tongue coating frequency and its colonization by yeasts in chronic kidney disease patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2016, 35(9):1455- 1462.

[8] Lin RY, Yu HY, Qin JY, et al. Association between tongue coating thickness and clinical characteristics among idiopathic membranous nephropathy patients. J Ethnopharmacol, 2015, 171:125-130.

[9] Hao Y, Yuan X, Yan J, et al. Metabolomic markers in tongue-coating samples from damp phlegm pattern patients of coronary heart disease and chronic renal failure. Dis Markers, 2019, 2019: 4106293.

[10] Nephrology Group of Academy of Pediatrics of Chinese Medicine Association. Diagnostic and evidence-based guidelines of Henoch-Schönlein purpura nephritis (2016). Chin J Pediatr, 2017, 55(9):647-651. (in Chinese)

中华医学会儿科学分会肾脏病学组. 紫癜性肾炎诊治循证指南(2016). 中华儿科杂志, 2017, 55(9):647-651.

[11] Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods, 2010, 7(5):335-336.

[12] Edgar RC. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Methods, 2013, 10(10):996-998.

[13] Jiang XT, Peng X, Deng GH, et al. Illumina sequencing of 16S rRNA tag revealed spatial variations of bacterial communities in a mangrove wetland. Microb Ecol, 2013, 66(1):96-104.

[14] Oberauner L, Zachow C, Lackner S, et al. The ignored diversity: complex bacterial communities in intensive care units revealed by 16S pyrosequencing. Sci Rep, 2013, 3:1413.

[15] Vaught J. Biobanking comes of age: the transition to biospecimen Science. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2016, 56:211-228.

[16] Sun S, Wei h, Zhu R, et al. Biology of the tongue coating and its value in disease diagnosis. Complement Med Res, 2018, 25(3):191-197.

[17] Lu H, Ren Z, Li A, et al. Tongue coating microbiome data distinguish patients with pancreatic head cancer from healthy controls. J Oral Microbiol, 2019, 11(1):1563409.

[18] Seerangaiyan K, Jüch F, Winkel EG. Tongue coating: its characteristics and role in intra-oral halitosis and general health-a review. J Breath Res, 2018, 12(3):034001.

[19] Ye W, Zhang Y, He M, et al. Relationship of tongue coating microbiome on volatile sulfur compounds in healthy and halitosis adults. J Breath Res, 2019, 14(1):016005.

[20] Bernardi S, Karygianni L, Filippi A, et al. Combining culture and culture-independent methods reveals new microbial composition of halitosis patients’ tongue biofilm. Microbiologyopen, 2020, 9(2):e958.

国家中医药行业科研专项（201507001-03）

庞爽，Email：pangshuang@fudan.edu.cn

2020-02-10

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.003