Rac1蛋白在人卵巢浆液性腺癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞SKOV3迁移能力的影响△

苏梦亚，黄平，齐冰丽，姚海荣，张纪妍

沧州市中心医院妇一科，河北 沧州 061000

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，病死率高，早期症状不明显，且无可靠的筛查方法，多数患者出现症状时往往已进展至晚期，且已发生腹腔种植与转移，病死率较高[1]。研究发现，世界范围内卵巢癌的发病率呈上升趋势，而且长期化疗使卵巢癌患者的精神处于焦虑、抑郁的状态，因此，有效的治疗方法成为高发病率、高转移率卵巢癌患者的迫切需要[2]。本研究通过体外实验观察Rac1蛋白在卵巢癌组织中的表达情况，探索其对卵巢癌恶性生物学行为的影响，从而为探索新的卵巢癌治疗方法提供理论依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年2月至2017年12月沧州市中心医院收治的90例卵巢肿瘤患者。纳入标准[3]：初诊为卵巢浆液性腺癌和卵巢良性浆液性囊腺瘤；对治疗方案知情且签署治疗知情同意书。排除标准：合并代谢功能障碍；合并心血管、脑血管、肝、肾等其他系统疾病；合并精神类疾病；妊娠期或哺乳期妇女；身体条件不允许接受化疗[4]。90例卵巢肿瘤患者的年龄为28～60岁，平均年龄为（43.39±7.54）岁；病程为2～9年，平均病程为（5.1±1.2）年。收集90例卵巢肿瘤患者的卵巢肿瘤组织标本，包括卵巢浆液性腺癌组织标本59例和卵巢良性浆液性囊腺瘤组织标本31例；同时，收集同期健康体检者的正常卵巢组织标本35例。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质印迹法（Western blot）检测Rac1蛋白表达 采用酶标仪检测蛋白样品浓度，取适量蛋白，加入溴酚蓝与RIPA裂解液，煮沸7 min，将蛋白样品彻底变性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳后，5%脱脂奶粉封闭90 min后，采用Western blot检测目标蛋白条带，根据条带灰度显示情况判断Rac1蛋白的相对表达量[5]。

1.2.2 构建稳定转染细胞株 设计siRNA靶序列，接入pSR-GFP/neo质粒，通过G418筛选稳定转染的细胞，验证Rac1表达缺失的细胞（构建的目的细胞株SKOⅤ3-Rac1i）[6]。采用iRNA干扰技术沉默内源性Rac1的表达，将设计合成的3条Rac1干扰片段分别与空质粒载体连接合成重组质粒，检测重组载体质粒pSR-GFP/neo-Rac1i是否构建成功。将构建成功的3条Rac1干扰质粒分别转染入SKOⅤ3细胞，72 h后提取总蛋白，Western blot检测各载体对Rac1蛋白的抑制率，检测3个干扰片段的干扰效果，选取载体抑制效果较好的片段质粒作为SKOⅤ3-Rac1i用于后续实验。

1.2.3 细胞划痕实验检测细胞迁移 将收集的全部细胞分为SKOⅤ3-Rac1i细胞组和野生型SKOⅤ3组，取处于对数生长期的细胞种植于6孔板内，用含丝裂霉素C的培养基培养细胞，然后于孔板底部进行划痕，并置入孵箱进行下一步培养。在固定范围内取样拍照，并用直尺测量同一部位的划痕宽度，观察不同时间点（0、24、48、72 h）的细胞迁移能力[7]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析和重复测量方差分析，多组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中Rac1蛋白的表达情况

卵巢浆液性腺癌组织中Rac1蛋白的相对表达量为（0.89±0.16），卵巢良性浆液性囊腺瘤组织中Rac1蛋白的相对表达量为（0.69±0.14），卵巢正常组织中Rac1蛋白的相对表达量为（0.72±0.13），组间比较，差异有统计学意义（F=24.666，P＜0.01）。卵巢浆液性腺癌组织中Rac1蛋白的相对表达量明显高于卵巢良性浆液性囊腺瘤组织和卵巢正常组织，差异均有统计学意义（t=5.875、5.326，P＜0.01）；卵巢良性浆液性囊腺瘤组织和卵巢正常组织中Rac1蛋白的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 构建Rac1缺失性表达细胞株

与阴性质粒比较，1号干扰片段质粒对Rac1蛋白的抑制率为（12.59±2.65）%，2号干扰片段质粒对Rac1蛋白的抑制率为（56.48±6.25）%，3号干扰片段质粒对Rac1蛋白的抑制率为（73.68±5.29）%。其中，3号干扰片段质粒的抑制效果较好，作为SKOⅤ3-Rac1i用于后续实验。

2.3 SKOV3-Rac1i细胞迁移能力的比较

划痕实验结果显示，不同时间点SKOⅤ3-Rac1i细胞组和野生型SKOⅤ3组SKOⅤ3-Rac1i细胞的迁移能力比较，差异有统计学意义（F时间=5.291，P时间＜0.05）；SKOⅤ3-Rac1i细胞组和野生型SKOⅤ3组SKOⅤ3-Rac1i细胞的迁移能力比较，差异有统计学意义（F组间=4.089，P组间＜0.05）；SKOⅤ3-Rac1i细胞组和野生型SKOⅤ3组SKOⅤ3-Rac1i细胞的迁移能力在组间和时间上存在交互作用（F交互=6.131，P交互＜0.05）。SKOⅤ3-Rac1i细胞组SKOⅤ3-Rac1i细胞24、28、72 h的迁移能力均低于野生型SKOⅤ3组，差异均有统计学意义（t=10.258、11.665、11.843，P＜0.05）。（表1）

表1 两组SKOⅤ3-Rac1i细胞不同时间点的迁移能力（±s）

表1 两组SKOⅤ3-Rac1i细胞不同时间点的迁移能力（±s）

组别野生型S K OⅤ3组S K OⅤ3-R a c 1 i细胞组0.3 8±0.0 2 0.1 8±0.0 2 0.5 8±0.1 0 0.3 5±0.0 3 0.8 1±0.2 0 0.5 2±0.1 2 2 4 h 4 8 h 7 2 h

3 讨论

卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的一类疾病，缺乏有效的早期诊断手段是其发病率和病死率较高的重要原因。随着RNA干扰技术的出现和发展，对卵巢癌抑癌基因和细胞免疫因素的研究对卵巢癌的临床诊断和治疗起着重要的指导作用[8-10]。卵巢癌的发展与某些蛋白的表达和基因的异常等密切相关，结合临床实践探究这些因子在卵巢恶性肿瘤中的表达情况及其与卵巢癌恶性生物学行为的关系逐渐成为该领域的研究热点，以期为卵巢癌的临床诊治提供理论依据[11-12]。

卵巢癌起病隐匿，易发生扩散。转移、侵袭是卵巢癌重要的生物学特征，而肿瘤细胞迁移的启动与细胞伸出伪足并与周围基质黏附有关，而Rac1参与调控细胞板状伪足的形成，进而调控卵巢癌细胞的迁移和侵袭。在各种致癌因素的作用下，卵巢局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其异常增生。卵巢癌细胞的迁移是由伪足的形成并与基质的黏附而启动的。Rac1蛋白在信号传导过程中具有重要功能。Rac1基因的转录产物在恶性组织中的表达，转录过程中通过选择性剪接Rac1b基因转录产物可增加一个外显子，这是一种持续的活性突变体，对于卵巢癌细胞的增殖有很大影响[13]。本研究探究了Rac1蛋白表达对卵巢癌细胞SKOⅤ3迁移能力的影响，结果显示，卵巢浆液性腺癌组织中Rac1蛋白的表达最活跃；下调SKOⅤ3-Rac1i的表达时，SKOⅤ3-Rac1i细胞的迁移能力下降（P＜0.05）。由于肿瘤的发生发展是一个多因素、多基因参与的生物学过程，单纯的某一肿瘤基因被阻断并不可能达到抑制肿瘤生长的目的，而利用RNAi可以针对同一基因家族保守序列的dsRNA同时抑制多个相关基因的表达。RNAi可使特定基因沉默，具有较强的干扰活力，是靶向基因治疗的有效手段，对推动肿瘤基因治疗的发展具有重要意义。本研究结果显示，3号干扰片段质粒对Rac1蛋白的抑制率较高，载体抑制效果较好，被作为SKOⅤ3-Rac1i；与野生型SKOⅤ3组相比，SKOⅤ3-Rac1i细胞组的迁移速度明显下降（P＜0.05）。提示下调Rac1表达后，SKOⅤ3细胞的迁移能力受到抑制。肿瘤细胞的侵袭方式包括间充质移动、变形虫样移动、集团移动[14]，这3种运动方式均需要肿瘤细胞内在的改变和外在因素的触发从而获得运动能力。Rac1是一类重要的信号转导分子，其过表达与卵巢癌的进展有关，可通过调节细胞周期从而促进卵巢癌细胞的增殖。激活的Rac1亦可通过调节MMP及其组织特异性抑制因子的表达，促进肿瘤细胞的侵袭。本研究发现Rac1蛋白在卵巢癌组织中呈高表达，说明Rac1蛋白过表达与卵巢癌的发生、发展密切相关。

有研究发现，肌动蛋白的表达可负调控Rac的激活，Rac1可作为肌动蛋白的靶点从而调控肿瘤细胞的迁移和增殖[15]。Tiaml蛋白可介导Rac1从无活性的鸟苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）转换为有活性的鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）。因此，Tiam1/Rac1信号在肿瘤细胞的侵袭和转移中具有重要作用。恶性肿瘤组织中Rac1的表达水平较高，且随着肿瘤恶化程度的增加，Rac1的表达呈增高趋势。Rac1的表达可作为反映卵巢癌进展和恶性程度的参考指标，具有预后意义。

综上所述，Rac1蛋白与卵巢癌的发生密切相关，其在卵巢癌中呈高表达，且其表达的缺失对于预测卵巢癌细胞的迁移能力有显著的临床价值。但本研究存在不足之处，如纳入的样本量不足，因此，在后续的研究中将进一步补充临床资料、扩大样本量，深入研究Rac1蛋白在卵巢癌发生发展中的作用，以进一步阐明卵巢癌发生、发展的潜在分子机制。