基于LC-MS/MS的酸枣叶总黄酮中6种成分定性定量分析

付 彩,崔小芳,裴香萍,杜晨晖,闫 艳*

(1 山西大学中医药现代研究中心,太原 030006;2 山西中医药大学中药学院;*通讯作者,E-mail:yanyan520@sxu.edu.cn)

酸枣叶(ZiziphiSpinosaeFolium)为鼠李科枣属植物酸枣(ZiziphusjujubaMill. Var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou)的干燥叶。始载于《本草纲目》,又名棘叶,具有“敛疮解毒,治胫臁疮”之功效[1]。现代药理研究表明,酸枣叶具有明显的镇静安神[2]、抗氧化[3]、保护肝脏[4]等多种保健功效。化学成分研究表明酸枣叶中含有丰富的黄酮[5]、皂苷[6]、氨基酸[7]、核苷[8]、微量元素[9]等营养成分。课题组前期采用紫外分光光度法测定山西省9个不同产地的酸枣叶样品中总黄酮的含量,发现山西晋中地区酸枣叶总黄酮含量最高且可达8%[5];采用超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Q-Exactive)与高效液相色谱-化学发光(HPLC-CL)技术分析发现酸枣叶中多以槲皮素和山奈酚为母核的黄酮为主,且能在线清除过氧化氢和超氧阴离子自由基[10]。为此我们优化了酸枣叶总黄酮的提取纯化工艺,富集了纯度为41.5%的总黄酮部位[11]。为了对提取纯化的酸枣叶总黄酮进行质量控制,本文将建立一种灵敏、高效、准确度高的含量测定方法。

超高效液相色谱-四极杆/线性离子阱串联质谱(UPLC-QTRAP-MS)技术是研究中药复杂成分的一种有效、可行的分析方法。传统的多反应监测扫描(mmultiple reaction monitoring,MRM)是定量分析的“金标准”;而线性离子阱的增强子离子扫描模式(enhanced product ion scanning,EPI)可获得相应的二级碎片,在化合物定量的同时起到定性的作用[12]。基于数据依赖性获取(information dependent acquisition,IDA)时,可实现多反应监测-触发增强子离子扫描(MRM-IDA-EPI),实现一次进样同时获得高灵敏度MRM的定量数据和二级全扫描质谱图进行定性确认。在不降低定性和定量分析性能的同时,既能实现高灵敏地定性鉴定化合物,又能在一次运行中准确定量特定目标化合物[13-15]。

本实验采用基于MRM-IDA-EPI模式的液质联用方法(LC-MS/MS)对酸枣叶总黄酮中芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素6种化学成分进行鉴定,同时对以上化合物进行含量测定,为后期药效学及药动学研究提供实验基础,同时将为酸枣叶总黄酮的开发利用提供合理的科学依据。

1 仪器与试药

Agilent1290Ⅱ超高效液相色谱仪,配有G7120A四元泵,G7116B柱温箱,G7167B自动进样器(美国Agilent公司);3200 QTRAP三重四级杆线性离子阱质谱仪,配有ESI离子源,Analyst 1.5.2 software数据系统(美国AB SCIEX公司);Neofuge13R高速冷冻离心机(中国力康公司);CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司);Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

对照品槲皮素-3-O-洋槐糖苷(批号:20161227)、芦丁(批号C1424058)、金丝桃苷(批号:20161022)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(批号:HI105405198)、槲皮苷(批号:20160830)均购自宝鸡辰光生物科技有限公司。槲皮素(批号:Q111274)购自阿拉丁试剂有限公司。经HPLC归一化法测定对照品的质量分数均大于98%。甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯,购自美国Thermo Fisher公司。超纯水由Milli-Q制备,其余试剂均为分析纯。

酸枣叶2017年10月采自山西省晋中市(样品编号:20170627004),经山西中医药大学中药鉴定教研室杜晨晖副教授鉴定为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubeMill. var.spinosa(Bunge) Huex H. F.Chou的干燥叶子。留样于山西大学中医药现代研究中心。酸枣叶经AB-8型大孔树脂纯化得总黄酮部位,得率为10%,纯度为41.5%。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC®HSS T3(150 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相为乙腈(A)-水(B)(含有0.1%甲酸);梯度洗脱条件:0-5 min 15%A,5-13 min 15%-16%A,13-17 min 16%A,17-20 min 16%-16.5%A,20-24 min 16.5%-100%A;流速为0.3 ml/min;柱温35 ℃;进样量2 μl。对照品和样品的MRM色谱图见图1。

左边一列为对照品,右边为酸枣叶总黄酮样品;1.槲皮素-3-O-洋槐糖苷;2.芦丁;3.金丝桃苷;4.槲皮素-3-O-葡萄糖苷;5.槲皮苷;6.槲皮素图1 对照品和酸枣叶总黄酮样品的MRM色谱图Figure 1 The representative MRM chromatograms of standard solution and Ziziphi Spinosae Folium sample

2.2 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描模式:MRM负离子扫描;源喷射电压(IS)为-4 500 V;雾化温度:550 ℃;气帘气(Curtain gas,N2):40.0 psi;雾化气(GS1,N2):50 psi;辅助气(GS2,N2):50 psi。全扫面模式下针泵进样6种指标成分对照品质谱参数见表1,从中选择出的6个定量离子见表2。

表1 全扫面模式下针泵进样6种成分的离子碎片Table 1 Full-scan model and the proposed fragmentation schemes of six components

表2 6种成分的保留时间和质谱分析参数Table 2 Retention time and MS parameters of the six components

MRM-IDA-EPI模式:IDA参数,select 1 to 1 most intense peaks;选择动态背景扣除(alter dynamic background subtraction of survey scan);阈值(which exceeds),500 cps。

EPI参数设置为扫描范围:50-650;扫描速率(scan rate):1 000 Da/s;离子阱动态填充(dynamic fill time);DP:-80 eV;EP:-10 eV;CES:(-45±15)eV。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 取对照品适量,精密称定,加70%的甲醇制备成槲皮素-3-O-洋槐糖苷和芦丁浓度为1 mg/ml的单一对照品储备液,加70%的甲醇制备成金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷和槲皮素浓度均为0.02 mg/ml的单一对照品溶液。分别精密吸取上述对照品储备液,适量加甲醇制成浓度分别为50,52.8,0.544,1.034,1.014,0.148 μg/ml的混合对照品储备液。

2.3.2 供试品溶液的制备 称取酸枣叶总黄酮粉末约10 mg,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加70%甲醇25 ml,称定质量,超声提取20 min。放置室温,再称定质量,用70%甲醇补足减失质量,0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.4 定性分析

按“2.1”和“2.2”项下色谱和质谱条件,分别对样品中6个化合物进行EPI参数的优化,获得高质量的二级碎片信息(见图2)。以芦丁为例,参考文献[16]发现,在负离子模式下,丢失芸香糖形成特征离子碎片301,碎片301继续裂解形成碎片273.0,255.1,179.0,151.0等。通过与对照品针泵进样离子碎片和文献[10]比较,其他5个化合物分别被鉴定为:槲皮素-3-O-洋槐糖苷、金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素。

图2 MRM-IDA-EPI模式下酸枣叶总黄酮6种化合物的EPI图谱Figure 2 EPI spectra for six components in Ziziphi Spinosae Folium based on MRM-IDA-EPI mode

由此可见,MRM-IDA-EPI模式与常见的三重四级杆扫描模式相比,增强了二级碎片离子扫描,使定性、定量分析更准确。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系、定量限和检测限 精密量取上述混合对照品溶液适量,用70%甲醇逐级稀释7个浓度梯度的混合对照品溶液。按“2.1”“2.2”项下色谱和质谱条件分析,以指标成分的峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X),进行线性回归,得回归方程、相关系数(r)和线性范围,结果6种指标成分的质量浓度和峰面积的相关系数(r)均大于0.999 5,表明该方法线性关系良好。将混合对照品溶液按照质量浓度梯度由高到低稀释,分别以信噪比S/N=10和S/N=3时各对照品的量作为定量限(LOD)和检测限(LOD),结果见表3。

表3 6种成分的回归方程、相关系数、线性范围、LOQ和LODTable 3 Regression equations, correlation coefficients and linearity ranges of the six components

2.5.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液,按“2.1”“2.2”项下色谱和质谱条件同一天内连续进样6次,记录6种指标成分的峰面积,并计算其峰面积的RSD值。连续3 d,每天精密吸取上述混合对照品溶液,按“2.1”“2.2”项下色谱和质谱条件同一天内连续进样3次,记录6种指标成分3 d的峰面积,并计算其峰面积的RSD值。结果显示,6个化合物的RSD值均小于3%(见表4),表明仪器的日间精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一批酸枣叶总黄酮粉末样品,约10 mg,精密称定,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,于室温放置0,2,4,6,12,24 h后按“2.1”“2.2”项下色谱和质谱条件进样分析,以峰面积为指标进行分析,计算6种指标成分峰面积的RSD值,结果显示,6个化合物的RSD值均小于3%(见表4),表明样品溶液在24 h内稳定。

2.5.4 重复性试验 取同一批酸枣叶总黄酮样品粉末6份,每份约10 mg,精密称定,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”“2.2”项下色谱和质谱条件进样分析,分别记录6种指标成分的峰面积,计算其质量分数及其RSD值。6份样品中槲皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素的含量依次为10.4%,8.3%,0.1%,0.3%,0.2%,0.005%,其RSD见表4,符合药典规定要求,表明样品提取方法的精密度良好。

表4 6种成分的精密度、重复性、稳定性Table 4 Stability, precision and repeatability of the six components

2.5.5 加样回收率试验 取已知6个成分含量的酸枣叶总黄酮样品6份,每份约5 mg,精密称定,置于具塞锥形瓶中,分别精密加入相当于5 mg样品中6种成分含量50%、100%、150%的混合对照品溶液,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”“2.2”项下色谱和质谱条件进样分析,记录指标成分的峰面积,计算其平均加样回收率及相应的RSD值。由表5可知,6种化合物的回收率在99%-108%的范围内,且RSD值均小于3%,表明提取方法的准确度良好。

表5 6种成分的加样回收率Table 5 Recovery of the six components

2.5.6 样品测定 分别取待测的酸枣叶总黄酮样品3份,每份约10 mg,精密称定,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”“2.2”项下色谱和质谱条件进样分析,记录指标成分的峰面积,计算6种指标成分的含量。3份样品中,槲皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素的平均含量分别为10.4%,8.3%,0.1%,0.3%,0.2%,0.005%(相当于酸枣叶总黄酮质量)。

3 讨论

本文建立了一种基于MRM-IDA-EPI模式的液质联用方法同时测定酸枣叶总黄酮含量的方法,并采用数据依赖扫描模式获得每个化合物的二级质谱信息,对化合物进行鉴别表征。现有的液质联用检测方法多采用多反应监测(MRM)扫描方式进行定性与定量检测,MRM检测灵敏度高、定量准确,但在定性的准确程度上依靠两离子对的丰度比进行最终确认不够严谨,检测中易出现假阳性峰干扰判断[17]。本文采用在MRM扫描方式下进一步联合EPI扫描可以在较低浓度条件下生成二级子离子全扫描图,同时定性定量分析。

酸枣叶总黄酮中含有大量的同分异构体,色谱条件直接影响到被分析化合物的分离效能。首先对流动相组成进行考察,在水相中分别加入0.1%和1%的甲酸,结果表明流动相中含有0.1%的甲酸时色谱峰的离子响应最大。此外,分别比较了ACQUITY UPLC®BEH C18,Atlantis®T3及ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱,结果表明ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱对黄酮类成分的分离效果最好。

本实验针泵进样优化MRM条件,分别对6个化合物的去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)进行优化,得到6个母离子和子离子离子对。当MRM信号低于IDA设定的阈值500 cps时,只进行MRM扫描;当MRM信号大于IDA设定的阈值500 cps时同时启动线性离子阱的EPI功能。为了得到丰富的二级碎片信息,继而对EPI参数进行优化,结果表明,当EPI中DP为80、CES为(40±15)eV时,6个化合物的碎片离子最丰富。含量测定结果表明,槲皮素-3-O-洋槐糖苷与芦丁这一对同分异构体为酸枣叶总黄酮的主要成分,两者的含量占总黄酮的19.35%。槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、金丝桃苷的含量相对较低,均小于0.3%,而槲皮素的含量最低为0.005%。由此可见,酸枣叶总黄酮以糖苷类成分为主,而这6种糖苷类成分均具有较强的抗氧化活性[18]。值得注意的是有报道研究槲皮素糖苷类化合物如槲皮苷等对H2O2和紫外(UV)损伤造成的人胚皮肤成纤维细胞(ESF-1)细胞衰老具有良好的保护作用[19]。而且在本次实验中含量高的芦丁也被报道可以通过抗氧化机制延缓D-半乳糖造成的大鼠的氧化衰老[20]。

基于以上分析,提示酸枣叶总黄酮可能具有延缓衰老的作用,有待进一步研究。酸枣叶总黄酮有望成为一种新型绿色的、可持续的抗氧化资源;有望开发为具有抗氧化、抗衰老功能的健康产品。同时本研究为后期的药效学及药动学研究提供物质基础和质量保证。