槲皮素对宫颈癌HeLa细胞凋亡、迁移的影响

唐阳芳,陈 蕊,张少华

(西安医学院第一附属医院妇科,西安 710077;*通讯作者,E-mail:68626817@qq.com)

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率仅次于乳腺癌、直肠癌。全世界每年约有50万初发宫颈癌患者,中国每年新发病例约13万,成为女性患者主要死因之一[1,2]。宫颈癌治疗以手术及放化疗为主,但由于化疗药物的神经毒性、关节肌肉疼痛、脱发等毒副反应及耐药等问题,使其临床应用受到了一定限制[3,4],急需寻找新的治疗手段。近年来,在各种抗肿瘤药物中,天然植物抗肿瘤药物因其低毒性、高利用度等特点已受到了医药学界的高度重视[5]。槲皮素是广泛存在于多种植物中的多醇羟基黄酮类化合物,研究证实其具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒、心血管保护、免疫调节等多种药理学活性[6]。目前研究表明,槲皮素具有抗宫颈癌作用,可抑制宫颈癌细胞增殖、促进宫颈癌细胞凋亡、抑制宫颈癌细胞侵袭和转移等[7,8],但作用机制尚不完全明确。氧化应激与宫颈癌等恶行肿瘤的发生、发展密切相关[9],也被作为宫颈癌的治疗靶点[10]。本研究以宫颈癌HeLa细胞为对象,观察槲皮素对HeLa细胞凋亡及迁移的影响,探讨氧化应激在其中的作用,为初步探索槲皮素在宫颈癌中的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

槲皮素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司),用DMSO超声裂解槲皮素溶解,配成不同质量浓度的溶液,用0.22 μm微孔滤器过滤,灭菌,4 ℃保存备用。10%胎牛血清、0.25%胰酶、DMEM(美国Gibco公司),细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司),Transwell迁移小室(美国BD公司),细胞活性氧(ROS)检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),丙二醛(MDA)测试试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 细胞培养及分组

常规复苏HeLa细胞,将细胞移到含有5 ml DMEM培养基的离心管中,室温1 200 r/min离心3 min,弃上清。用DMEM培养基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素)悬浮细胞,接种到培养皿中,轻轻吹打混匀,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。每2-3 d传代换液1次,取对数生长期的细胞进行实验。将处于对数生长期的细胞,用0.25%胰酶消化、收集细胞,用DMEM培养基制成单细胞悬液,按照每孔5×105个将细胞均匀的接种到6孔板中,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件培养过夜。加不同浓度槲皮素(0,20,40,80 μmol/L)处理48 h,不加槲皮素组(0 μmol/L)设为对照组。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡

用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞,终止消化后收集细胞,1 500 r/min离心5 min,弃上清,加PBS重悬。用PBS将细胞润洗2次,1 500 r/min离心5 min。按照Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行:加入500 μl Binding Buffer,重悬细胞;5 μl Annexin Ⅴ-FITC混匀后加入5 μl PI,混匀;室温避光反应15 min(同时设阴性对照,即正常细胞不加Annexin和PI);流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.4 Transwell法检测细胞迁移

取上述处理48 h的细胞,0.25%胰酶消化、收集细胞,室温1 200 r/min离心3 min,去上清,PBS润洗2次,清洗掉残余血清。无血清培养基重悬细胞,细胞计数板计数,用无血清培养基稀释细胞浓度至2×105/ml,备用。在24孔板中加入800 μl 10%FBS培养基(含双抗),并放入Transwell小室,在Transwell上室分别接入200 μl各组细胞悬液,37 ℃,5% CO2培养48 h。取出Transwell,PBS小心清洗小室1次,70%冰乙醇溶液固定细胞1 h。0.5%结晶紫染液染色,室温放置20 min,PBS清洗后用干净棉球将上室一侧未迁移的细胞擦净,然后显微镜观察拍照,计数迁移细胞数。

1.5 DCFH-DA检测细胞内ROS水平

用不含EDTA的0.25%胰酶消化、收集细胞,1 500 r/min离心5 min,去上清,加PBS重悬。用PBS将细胞润洗2次,1 500 r/min离心5 min。按照DCFH-DA细胞ROS检测试剂盒操作说明进行:向细胞沉淀中加入稀释好的DCFH 1 ml;37 ℃培养箱孵育20 min,每隔3 min混匀1次;用无血清培养基洗涤细胞3次;流式细胞仪检测细胞DCFH-DA荧光强度。

1.6 MDA含量检测

样品前处理:HeLa细胞置于EP管中,加入一定量的低渗溶液或双蒸水,直接放入液氮3-5 s,立即提出转入-20 ℃冰箱(20-30 s),再取出室温解冻,解冻后按上述步骤重复3次,即对细胞进行反复冻融。将匀浆液于5 000 r/min离心5 min,取上清待用。按照MDA测试试剂盒操作说明进行,漩涡混匀器混匀,试管口用保鲜膜扎紧,用针头刺一个小孔,95 ℃水浴40 min,取出后流水冷却,然后3 500 r/min离心10 min。取上清测532 nm处吸光值OD,计算细胞MDA含量。MDA含量(nmol/mg)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(10 nmol/L)/待测样本蛋白浓度(mg/ml)。

1.7 总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力检测

样品前处理同1.6,按照T-SOD测试盒进行操作,混匀,室温放置10 min,于波长550 nm处测定吸光度值OD。总SOD活力(U/mg)=(对照OD-测定OD)/对照OD/0.5×(反应液总体积/取样量)/蛋白浓度。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 槲皮素对HeLa细胞凋亡的影响

在显微镜下观察细胞形态发现,与0 μmol/L相比,槲皮素处理细胞48 h,不同浓度组HeLa细胞生长受到明显抑制(见图1)。进一步采用流式检测细胞凋亡,结果显示与0 μmol/L相比,各浓度槲皮素组的细胞凋亡率明显上升,且凋亡率随着槲皮素浓度的升高而增加。0,20,40,80 μmol/L槲皮素组凋亡率分别为 (4.61±0.76)%,(9.47±0.54)%,(14.78±0.93)%,(23.34±1.96)%,各组之间比较,差异有统计学意义(均P<0.05,见图2)。

图1 不同浓度槲皮素处理的HeLa细胞形态观察Figure 1 Morphology of HeLa cells in different treatment groups

图2 槲皮素对HeLa细胞凋亡的影响 (n=3)Figure 2 Effect of quercetin on apoptosis of HeLa cells (n=3)

2.2 槲皮素对HeLa细胞迁移的影响

Transwell细胞迁移实验结果发现,与0 μmol/L相比,不同浓度槲皮素处理细胞48 h,HeLa细胞迁移受到明显抑制,且迁移数随着槲皮素浓度的升高而减少。0,20,40,80 μmol/L槲皮素组的细胞迁移数分别为(104.67±5.03)个,(94.00±3.46)个,(75.00±9.54)个,(55.67±4.62)个。各组之间比较,差异有统计学意义(均P<0.05,见图3)。

图3 槲皮素对HeLa细胞迁移的影响 (n=3)Figure 3 Effect of quercetin on migration of HeLa cells (n=3)

2.3 槲皮素对细胞表达ROS的影响

流式检测ROS的实验结果发现,与0 μmol/L相比,不同浓度槲皮素处理细胞48 h,HeLa细胞中ROS表达增加,且随着槲皮素浓度的升高而增加。0,20,40,80 μmol/L槲皮素组的ROS表达量(DCFH-DA荧光强度)分别为65 402.00±886.87,76 497.00±9 648.64,95 774.66±3 440.82,106 135.00±3 724.35。各组之间比较,差异有统计学意义(均P<0.05,见图4)。

图4 槲皮素对HeLa细胞ROS表达的影响 (n=3)Figure 4 Effect of quercetin on the expression of ROS in HeLa cells (n=3)

2.4 槲皮素对细胞表达MDA的影响

试剂盒检测细胞MDA含量的实验结果发现,与0 μmol/L相比,不同浓度槲皮素处理细胞48 h,HeLa细胞中MDA表达增加,且随着槲皮素浓度的升高而增加。0,20,40,80 μmol/L槲皮素组MDA含量分别为(1.85±0.06)nmol/mg,(2.52±0.22)nmol/mg,(3.50±0.24)nmol/mg,(4.19±0.43)nmol/mg。各组之间比较,差异有统计学意义(均P<0.05,见图5)。

与0 μmol/L相比,* P <0.05;与20 μmol/L相比,#P <0.05;与40 μmol/L相比,&P <0.05图5 槲皮素对HeLa细胞MDA含量的影响 (n=3)Figure 5 Effect of quercetin on the content of MDA in HeLa cells (n=3)

2.5 槲皮素对细胞SOD活力的影响

试剂盒检测细胞总SOD活力的实验结果发现,与0 μmol/L相比,不同浓度槲皮素处理细胞48 h,HeLa细胞中SOD活力下降,且随着槲皮素浓度的升高而下降。0,20,40,80 μmol/L槲皮素组的总SOD活力分别为(75.28±0.39)U/mg,(62.84±3.76)U/mg,(52.61±1.51)U/mg,(35.52±3.72)U/mg。各组之间比较,差异有统计学意义(均P<0.05,见图6)。

与0 μmol/L相比,* P <0.05;与20 μmol/L相比,#P <0.05;与40 μmol/L相比,&P <0.05图6 槲皮素对HeLa细胞SOD活力的影响 (n=3)Figure 6 Effect of quercetin on the activity of total SOD in HeLa cells (n=3)

3 讨论

宫颈癌是常见的生殖系统恶性肿瘤,发病率及死亡率较高,且年轻化趋势明显,严重危害广大妇女的健康和生命[1,11]。目前宫颈癌的治疗手段以手术为主、放化疗为辅,但治疗效果不理想,副作用较多,预后率低,费用较高,因此寻找放化疗中毒副作用小且疗效确切的辅助药物成为研究热点[12]。据报道,槲皮素在多种恶性肿瘤中发挥抗癌活性,如乳腺癌、肝癌、肺癌、白血病等[6-8]。国内外研究也认为槲皮素具有治疗宫颈癌的生物学活性[7]。癌细胞具有无限增殖的特点,大量研究结果提示,槲皮素可不同程度地抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,且呈时间和浓度依赖性[13,14]。细胞凋亡是细胞的程序性死亡,维持细胞的健康生存和死亡平衡。凋亡信号有助于保护基因组的完整性,而凋亡缺陷可能促进肿瘤的发生。肿瘤细胞可能通过多种分子机制抑制细胞凋亡并获得对凋亡因子的抗性[15]。细胞凋亡是肿瘤治疗中的关注要点,很多抗癌药物是通过诱导各自敏感的细胞发生凋亡来实现的[16]。有研究表明,槲皮素可以诱导HeLa细胞凋亡[17-19],本研究应用流式细胞仪检测不同浓度的槲皮素作用于HeLa细胞后细胞凋亡率的变化,也提示细胞凋亡率随着药物浓度的升高而增加。此外,肿瘤细胞的侵袭力与癌症发展转移密切相关,本研究还利用穿透小室Transwell法检测了HeLa细胞迁移能力,结果提示槲皮素可以抑制细胞的迁移能力,且呈浓度依赖性,与既往报道采用其他研究方法得出的结果相符[19,20]。结合本研究结果,认为槲皮素的抗癌活性主要与其抑制癌细胞增殖与转移,诱导细胞凋亡密切相关[6,8]。此外,据报道槲皮素与化疗药物联用能起到化疗增敏作用,并有效逆转肿瘤细胞的多重耐药性[21],这可能是槲皮素发挥抗癌作用的另一机制。

机体在遭受外界各种有害刺激的时候,会发生应激反应而产生大量的高活性分子,如ROS,以应对外界对组织和细胞造成的损伤。当机体产生的ROS自由基过多,超出机体的清除能力,进而引起氧化与抗氧化之间失衡的病态生理现象被称为氧化应激。机体存在两类抗氧化系统,其中一类是抗氧化酶系统,包括SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等,另一类是非酶抗氧化系统,由许多具有抗氧化能力的非酶类物质组成。以上抗氧化系统协同负责将ROS从高活性的自由基转化成低活性分子,从而阻止ROS转化成更具危害性的物质,降低对细胞的氧化损伤[22,23]。以槲皮素为代表的天然抗氧化功能因子具有清除自由基及上调机体抗氧化酶系统活性的作用,对机体氧化还原状态的调节有积极意义[24]。但随着研究的深入,越来越多的研究发现包括槲皮素在内的部分黄酮类化合物,在高浓度、长时间作用时发挥促氧化作用,会造成机体ROS水平升高,抗氧化酶活性下降等。槲皮素清除自由基的中间产物具有生物毒性,可能是导致其促氧化作用出现的原因之一[25,26]。

宫颈癌的发生发展是一个复杂的病理过程,涉及多条信号通路的交互作用,因此寻找可靠的抗癌靶点以及明确抗癌药物的作用机制意义重大。ROS等自由基诱导机体产生的氧化应激与人体多种慢性疾病,包括癌症的发生发展关系密切[27]。除ROS外,在氧化应激过程中的丙二醛(MDA)是ROS与细胞膜磷脂的不饱和脂肪酸反应形成的物质,是评价氧化应激的一个非常重要的指标。对SOD的检测和评价是作为氧化应激和抗氧化最常用的另一指标[28]。在绝大多数情况下,槲皮素具有抗氧化活性[6]。为了明确槲皮素对宫颈癌中氧化应激的影响,本研究检测了各组细胞内ROS、MDA含量以及T-SOD活力,结果发现20 μmol/L及以上浓度的槲皮素处理细胞48 h,可以明显上调ROS、MDA水平,降低T-SOD活力,说明该实验条件下槲皮素对正常HeLa细胞发挥促氧化作用。以上研究结果与在肝癌中的研究结果类似[29],证实高浓度槲皮素作用时间长时可发挥明显的促氧化效应。由于槲皮素能明显诱导HeLa细胞凋亡,而ROS的增多与细胞凋亡有关[19,30],我们推测槲皮素诱导HeLa细胞凋亡的机制可能与其促氧化效应有关。

综上所述,本研究提示槲皮素能够通过诱导凋亡、抑制迁移抑制宫颈癌细胞生长,且呈剂量依赖性,其机制可能与槲皮素促进细胞内氧化应激有关。不过,槲皮素对HeLa的作用是否与促氧化直接相关,二者之间的因果关系如何还需要进一步验证。另外,体外细胞实验结果不能完全反映体内真实情况,还有待于在宫颈癌动物模型甚至患者中进行观察,为将槲皮素用于宫颈癌的临床治疗提供理论依据。