木犀草素靶向PI3K通路对鼻咽癌细胞迁移、侵袭及上皮间质转化的影响

程忠强,蒋成义,詹晓东

(蚌埠医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科,蚌埠 233003;*通讯作者,E-mail:zxdent2007@aliyun.com)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中国高发恶性肿瘤之一,发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。NPC早期症状不明显,但其恶性程度高,早期可发生局部淋巴结转移甚至远处转移,约70%患者确诊时已进入中晚期,多预后差[1,2]。目前临床治疗NPC多以手术切除结合放疗和(或)辅助化疗为主,但大多患者对放疗中度敏感且会引起全身后遗症,而约75%患者会出现化疗耐药性,临床效果不佳[3,4],因此急需寻找新型治疗药物。木犀草素(luteolin,LUT)是一种天然的四羟基黄酮化合物,在多种药用植物中广泛存在,具有消炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性,在结肠癌[5]、肝癌[6]、乳腺癌[7]等多种肿瘤中发挥抑癌作用,但对NPC的作用尚少有研究。研究发现[8-10],磷脂酰肌醇-3-羟基激酶(PI3K)通路与NPC高分化细胞株CNE-1增殖、迁移和侵袭密切相关,而肿瘤侵袭、迁移过程中上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)机制又发挥重要作用。基于此,本研究拟通过探究LUT靶向PI3K通路对NPC CNE-1细胞迁移、侵袭及EMT的影响,以期揭示其作用机制,为临床治疗NPC的新药开发研究提供一定理论参考。

1 材料与方法

1.1 细胞株、试剂及仪器

人鼻咽癌CNE-1细胞株购自美国ATCC细胞库;木犀草素(luteolin,LUT,货号:491-70-3)购自Sigma-Aldrich公司;RPMI-1640培养基(货号:21870084)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,货号:10099141C)均购自美国Gibco公司;MTT试剂盒(货号:11465007001)购自美国Sigma公司;蛋白抽提试剂盒(货号:P0028)、BCA蛋白定量试剂盒(货号:P0010S)、PI3K通路抑制剂LY294002(货号:S1737)购自上海碧云天公司;鼠源一抗anti-PI3K p85(货号:MA5-32917)、anti-AKT(货号:AHO1112)、anti-E-cadherin(货号:33-4000)、anti-Vimentin(货号:MA5-11883)、anti-GAPDH抗体(货号:AM4300),兔源anti-p-PI3K p85(货号:PA5-104853)、anti-p-AKT(货号:MA5-14916)抗体,二抗羊抗鼠IgG(货号:A-11001)、羊抗兔IgG(货号:A-11008)均购自美国Invitrogen公司;鼠源一抗anti-MMP-2(货号:ab86607)、anti-MMP-9(货号:ab11906)购自英国Abcam公司;Evolution 220紫外分光光度计、FC酶标仪、Forma Steri-Cycle i160 5%CO2培养箱购自美国Thermo Fisher公司等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 常规复苏CNE-1细胞后,置于10% FBS、1%青链霉素RPMI-1640培养基中,于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养,细胞融合至80%-90%时进行传代,用0.25%胰蛋白酶消化处理。

1.2.2 MTT检测细胞存活 将对数期生长CNE-1细胞制备单细胞悬液,以细胞密度为3×104个/孔接种于96孔细胞板,分别添加LUT使其终浓度为20,40,60 μmol/ml,设为LUT低剂量组(LUT-L组)、中剂量组(LUT-M组)、高剂量组(LUT-H组),另设置在LUT低剂量基础上添加PI3K通路抑制剂LY294002 1 μmol/ml为LY294002组,同时设正常培养CNE-1细胞为正常对照组(NC组),均培养48 h,每组6个复孔。培养结束后采用MTT试剂盒检测各组CNE-1细胞存活率,具体操作严格按照试剂盒说明书进行。细胞存活率=(OD实验组/ODNC组)×100%。

1.2.3 Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭 取对数期生长CNE-1细胞调整浓度为1×106个/孔接种于6孔细胞板,细胞分组同1.2.2。培养结束收集各组CNE-1细胞,调整浓度至1×105个/ml,取200 μl分别接种于铺有或无matrigel胶的Transwell板小室中培养24 h后,90%乙醇固定,0.1%结晶紫常温染色后,于倒置显微镜下观察穿过膜的细胞数,每张膜中央及周围部分各随机取5个视野,分别计算穿过聚碳酸酯膜微孔的细胞数。

1.2.4 免疫印迹(Western blot)检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MMP-2、MMP-9、E-cadherin和vimentin蛋白表达 提取各组CNE-1细胞总蛋白并采用BCA法测定蛋白浓度,具体操作参照蛋白提取试剂盒,蛋白样品置于-80 ℃保存备用。取50 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,湿转法转膜,5%脱脂奶粉室温封闭,分别添加一抗anti-PI3K(1 ∶1 000)、anti-p-PI3K(1 ∶500)、anti-AKT(1 ∶500)、anti-p-AKT(1 ∶500)、anti-基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)(1 ∶500)、anti-MMP-9(1 ∶1 000)、anti-钙黏蛋白(E-cadherin)(1 ∶500)、anti-波形蛋白(vimentin)(1 ∶200)、anti-GAPDH(1 ∶1 000),4 ℃孵育过夜,TBST缓冲液洗膜3次,添加二抗IgG(1 ∶5 000)室温孵育1 h,洗膜,显色,曝片,观察并分析结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 LUT对鼻咽癌CNE-1细胞存活率的影响

与NC组比较,LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组和LY294002组鼻咽癌CNE-1细胞存活率显著降低(P<0.05),而LY294002组高于LUT-H组(P<0.05,见表1)。

表1 各组鼻咽癌CNE-1细胞存活率比较Table 1 Comparison of cell viability of nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.2 LUT对鼻咽癌CNE-1细胞迁移的影响

与NC组比较,LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组和LY294002组鼻咽癌CNE-1细胞迁移细胞数显著降低(P<0.05),而LY294002组高于LUT-H组(P<0.05,见图1、表2)。

图1 LUT对鼻咽癌CNE-1细胞迁移的影响Figure 1 Effect of LUT on migration of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells

表2 各组鼻咽癌CNE-1细胞迁移和侵袭比较Table 2 Comparison of migratory cells of nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.3 LUT对鼻咽癌CNE-1细胞侵袭的影响

与NC组比较,LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组、LY294002组鼻咽癌CNE-1细胞侵袭细胞数显著降低(P<0.05),而LY294002组高于LUT-H组(P<0.05,见图2、表2)。

图2 LUT对鼻咽癌CNE-1细胞侵袭的影响Figure 2 Effect of LUT on invasion of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells

2.4 LUT对鼻咽癌CNE-1细胞PI3K通路相关蛋白表达的影响

与NC组比较,LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组和LY294002组鼻咽癌CNE-1细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt显著降低(P<0.05),而LY294002组高于LUT-H组(P<0.05,见图3、表3)。

图3 Western blot检测鼻咽癌CNE-1细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达Figure 3 Expression of p-PI3K, PI3K, p-Akt and Akt proteins in nasopharynx cancer CNE-1 cells detected by Western blot

表3 各组鼻咽癌CNE-1细胞中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比较Table 3 Comparison of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt levels in nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.5 LUT对鼻咽癌CNE-1细胞迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

与NC组比较,LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组和LY294002组鼻咽癌CNE-1细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而LY294002组高于LUT-H组(P<0.05,图4、表4)。

图4 WB检测鼻咽癌CNE-1细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达Figure 4 Expression of MMP-2 and MMP-9 proteins in nasopharynx cancer CNE-1 cells detected by Western blot

表4 各组鼻咽癌CNE-1细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平比较Table 4 Comparison of MMP-2 and MMP-9 protein expression in nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.6 LUT对鼻咽癌CNE-1细胞EMT相关蛋白表达的影响

与NC组比较,LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组和LY294002组鼻咽癌CNE-1细胞E-cadherin蛋白表达水平显著增加(P<0.05),而LY294002组低于LUT-H组(P<0.05);vimentin蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而LY294002组高于LUT-H组(P<0.05,见图5、表5)。

图5 WB检测鼻咽癌CNE-1细胞中E-cadherin、vimentin蛋白表达Figure 5 Expression of E-cadherin and vimentin proteins in nasopharynx cancer CNE-1 cells detected by Western blot

表5 各组鼻咽癌CNE-1细胞中E-cadherin、vimentin蛋白表达水平比较Table 5 Comparison of E-cadherin and vimentin protein expression in nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

3 讨论

近来,寻找安全、有效、副作用小的肿瘤化疗替代药物成为研究热点之一。LUT是一种天然黄酮类化合物,多以糖苷形式存在于全叶青兰、野菊花、金银花、紫苏等多种药用植物中,具有镇咳祛痰、消炎、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤及抑制血管形成等多种作用[11,12]。Fan等[13]研究报道,黄酮类化合物LUT可通过抑制Src/Stat3/S100A7信号通路抑制鳞状上皮细胞癌的迁移和侵袭。Yin等[14]研究报道,氰苷-3-O-葡萄糖苷与LUT协同抑制结肠癌和乳腺癌细胞的生长。本研究根据预实验结果,设置LUT低、中、高浓度分别为20,40,60 μmol/L进行实验研究,结果发现,与NC组比较,LUT-L组、LUT-M组和LUT-H组NCP CNE-1细胞存活率显著降低,且呈剂量依赖性,提示LUT可抑制NCP CNE-1细胞增殖。

迁移、侵袭是肿瘤细胞区别于正常细胞的恶质性特征,也是导致肿瘤复发、患者死亡的重要原因。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,本身具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶的活性,也具有磷脂酰肌醇激酶的活性,Akt是其主要下游效应分子,Akt活化是PI3K通路发挥作用的关键步骤,PI3K/Akt通路广泛存在于多种肿瘤细胞中,与其增殖、迁移和侵袭密切相关。李仕晟等[15]研究报道,针对PI3K/Akt信号通路的NPC靶向治疗可逆转EB病毒膜潜伏蛋白1(Epstein-Barr virus membrane latent protein 1,LMP1)诱导的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)抵抗作用,抑制PI3K/Akt信号通路可显著提高CNE-1-LMP1细胞对TRAIL的敏感性。付银锋等[16]研究报道,LUT可抑制黑素瘤A375和B16F10细胞增殖、侵袭,诱导其凋亡,可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。钟烨等[17]研究报道,LUT可通过PI3K/AKT信号通路下调甲状腺乳头状癌TPC-1细胞MMP2、MMP9蛋白表达,抑制侵袭和迁移能力。本研究结果发现,与NC组比较,LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组和LY294002组鼻咽癌CNE-1细胞迁移、侵袭细胞数、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低,而LY294002组均高于LUT-H组。MMPs可降解细胞外基质中各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,促进其迁移、侵袭,以MMP-2、MMP-9蛋白研究居多,提示LUT可抑制NPC CNE-1细胞迁移、侵袭,可能与靶向抑制PI3K/Akt信号通路,下调MMP-2、MMP-9蛋白表达有关。

EMT是指上皮细胞到间质细胞的转化,亦与细胞转移和侵袭能力密切相关。其中细胞黏附分子E-cadherin蛋白表达缺失及间质细胞标志蛋白vimentin蛋白表达上调是其重要特征,也是肿瘤形成的关键步骤[18,19]。Yu等[20]研究报道,磷酸酶1核靶向亚基(phosphatase 1 nuclear-targeting subunit,PNUTS)通过PI3K/AKT信号通路介导E-cadherin蛋白表达下调、vimentin蛋白表达上调,促进电离辐射诱导的NPC CNE-2细胞迁移、侵袭和EMT。Chen等[21]研究报道,LUT通过干扰PI3K/Akt-NF-κB信号通路下调E-cadherin蛋白表达,减弱TGF-β1诱导的肺癌细胞EMT过程。本研究结果发现,与NC组比较,LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组和LY294002组鼻咽癌CNE-1细胞E-cadherin蛋白表达水平显著增加,而LY294002组均低于LUT-H组;vimentin蛋白表达水平显著降低,而LY294002组均高于LUT-H组。提示LUT可能通过PI3K/AKT信号通路介导NPC CNE-1细胞E-cadherin蛋白表达上调和vimentin蛋白表达下调,抑制其EMT过程。

综上所述,LUT可能通过靶向抑制PI3K通路抑制鼻咽癌CNE-1细胞迁移、侵袭,抑制其EMT过程,该发现可对LUT在NPC临床治疗应用提供一定理论依据。但本研究仅在细胞水平上证实LUT的抗NPC作用,存在不足,后期仍需进行动物实验,探究其安全剂量,以待更加明确其作用机制。