转录因子Sp1调控H9C2心肌细胞Kv2.1钾通道的研究

黄晓燕 应雨晨

心肌细胞膜表面钠、钾、钙等离子通道异常，离子通道间平衡失调、心肌电信号传导紊乱，从而导致心律失常的发生。Kv2.1是电压门控性钾离子通道（voltage-gated potassium channels，Kv）的成员之一，由6个跨膜区和1个孔区组成四聚体结构，主要介导动作电位复极化过程。Kv2.1通道广泛表达于神经元和心肌细胞[1-2]，是延迟整流钾电流的主要分子基础，抑制该电流可使复极延迟，并使动作电位时程延长。本研究旨在观察转录因子Sp1对H9C2心肌细胞Kv2.1钾通道的影响，进一步明确心律失常发生的离子机制以及Sp1的调控作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1材料和试剂DMEM购自美国Thermo scientific公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，转染试剂（lipofectaminTM2000）购自美国Invitrogen公司，兔抗Kv2.1多克隆抗体购自美国Abbkine公司，膜片钳系统及分析软件为美国Axon公司产品。

1.2方法

1.2.1 pEGFP-N2-Sp1质粒构建 根据NCBI Gene数据库获得并合成Sp1原始序列，两端添加有酶切位点XhoI（CTCGAG）-KpnI（GGTACC），以亚克隆方式将目的片段与pEGFP-N2载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，扩增、抽提质粒，经测序验证成功构建pEGFP-N2-Sp1质粒。

1.2.2 细胞培养、转染H9C2细胞常规用含10%胎牛血清DMEM培养基，置于37℃5% CO2培养箱培养。根据LipofectaminTM2000说明书提供的实验步骤，将2.5μg pEGFP-N2-Sp1质粒，瞬时转染H9C2细胞。同时共转染0.8μg绿色荧光蛋白pRK5-GFP以监测转染效率。

1.2.3 Western blot法检测Kv2.1钾通道蛋白 空质粒和pEGFP-N2-Sp1质粒分别转染H9C2心肌细胞，设立pEGFP-N2-Sp1组和对照组。收集各组细胞，加入预冷RIPA细胞裂解液。取细胞裂解上清液20μL，点样于8%SDS-PAGE，电泳后电转至PVDF膜。兔抗Kv2.1多克隆抗体1∶500稀释，4℃孵育过夜。二抗采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，1∶1 000稀释，室温孵育2 h，最后在化学发光系统中观察拍照。

1.2.4 全细胞膜片钳记录法检测Kv2.1钾通道电流室温（24～26℃）下采用全细胞膜片钳技术观察Sp1对Kv2.1电流的影响。电极外液配方：60 mM NaCl，80 mM葡萄糖酸钠，0.1 mM CaCl2，1 mM MgCl2，5 mM KCl，10 mM HEPES和10 mM葡萄糖（用NaOH将pH调至7.4）。电极内液：0.5 mM MgCl2，30 mM KCl，110 mM葡萄糖酸钾，10 mM EGTA，5 mM HEPES，5 mM Na2ATP和1 mM GTP-tris（用KOH将pH调至7.2）。灌注电极内液后电极入水电阻为3～5 mΩ；刺激程序由Clampex 9.2软件和Axon 700B放大器共同完成，信号经过Axon 700B放大器和A/D转换后储存于计算机中。记录激活电流刺激方案如下：细胞钳制在-60 mV，测试电压从-70 mV，以10 mV的阶跃，刺激到+50 mV，持续300 ms；然后去极化到-40 mV，持续100 ms。记录稳态失活电流刺激方案如下：细胞钳制在-50 mV，测试电压以20 mV阶跃从-60 mV刺激到40 mV，持续时间10 s；然后测试电压钳制在50 mV时记录电流。每组采集6个细胞的稳态失活电流数据，经最大电流标准化，用Boltzmann方程拟合，得到半失活最大电压V1/2和斜率因子k值。

1.3统计学处理 采用pCLAMP Ver.9.2软件（Axon Instruments，California，USA）编辑刺激程序、记录电流并分析测量原始数据。Excel和Origin7.5软件对原始数据进行统计、拟合、作图。计量资料以表示，比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sp1对Kv2.1钾通道蛋白表达的影响 见图1。

注：与对照组比较，*P＜0.05

由图1可见，空质粒和pEGFP-N2-Sp1分别转染H9C2心肌细胞后，pEGFP-N2-Sp1组Kv2.1通道蛋白灰度值高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 Sp1对Kv2.1通道电流密度的影响 见图2。

由图2可见，与对照组相比，pEGFP-N2-Sp1组Kv2.1通道电流明显增强，具有电压依赖性。+50 mV处，对照组电流密度为（36.88±7.25）pA/pF，pEGFPN2-Sp1组为（66.05±5.42）pA/pF，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），Sp1干预后电流密度增加了79.09%。

2.3 Sp1对Kv2.1通道电流激活特性的影响 见图3。

从图2的Kv2.1通道电流曲线图，通过单指数方程得到激活时间常数。由图3可见，对照组的激活时间常数在+10 mV处为（18.86±1.68）ms，而在+40 mV处变为（7.67±0.77）ms，表明随着细胞膜去极化程度的增加，Kv2.1通道的激活加快，Kv2.1通道激活时间常数具有电压依赖性。Sp1干预后，通道+40 mV处pEGFP-N2-Sp1组的激活时间常数由（7.67±0.77）ms变为（5.58±0.28）ms。

注：与对照组比较，*P＜0.05

图3 Sp1对Kv2.1通道电流激活特性的影响

2.4 Sp1对Kv2.1通道电流失活特性的影响 见图4。

由图4可见，Sp1干预前后半失活最大电压V1/2分别为（-7.96±1.07）mV和（-8.43±1.98）mV（n=6，P＞0.05），斜率因子k值分别为（9.59±1.74）mV和（11.56±1.84）mV（n=6，P＞0.05）。

3 讨论

转录因子Sp1属于Sp/KLF样转录因子家族成员，在体内广泛表达，具有诱导细胞增殖和分化等功能，是目前研究极为广泛和系统的转录因子之一[3-4]。Sp1利用羧基末端3个C2H2类型的锌指结构作为DNA结合区域，与靶基因富含GC的区域结合，从而调控其下游靶基因的表达。Sp1是肿瘤细胞的生存、增殖和侵袭过程中非常关键的调节因子[5-6]。研究发现Sp1也参与心血管疾病的发生、发展，参与调节心肌细胞凋亡、心肌纤维化、炎症、氧化应激和血管内皮细胞损伤、血管钙化等多种病理生理过程[7-9]。Zhang等[10]研究发现miR-374通过激活PI3K/Akt通路抑制Sp1进而抑制心肌细胞凋亡，从而对心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）发挥保护作用。Guo等[11]通过建立H9C2心肌细胞急性缺氧损伤模型，发现microRNA-101通过调节Sp1/survivin途径减轻缺氧诱导的心肌细胞损伤。但是，有关Sp1在心律失常中的作用，尤其是Sp1调控心肌细胞Kv2.1钾通道的研究报道目前较少。

图4 Sp1对Kv2.1通道电流失活特性的影响（A、B：Sp1干预前后记录到的稳态失活电流曲线图；C：稳态失活电流经最大电流标准化，用Boltzmann方程拟合，得到稳态失活拟合图）

有研究显示[12]，三氧化二砷具有心脏毒性反应，通过抑制人类ether-a-go-go相关基因（human ether-a-go-go-related gene，hERG），钾通道转运至细胞膜，导致获得性长QT综合征的发生，而苦参碱和氧化苦参碱能够通过上调Sp1的表达，增强hERG通道活化和表达，缩短了豚鼠心室肌细胞三氧化二砷延长的动作电位持续时间。本研究发现Sp1能促进Kv2.1通道蛋白和电流表达增强，+50 mV处Kv2.1通道电流密度较干预前增加了79.09%。可见Sp1能够正向调控Kv2.1通道蛋白表达和Kv2.1通道电流。

Kv2.1通道的重要特性之一就是电压敏感性，可被膜电位去极化而激活。既往研究表明非选择性β受体阻滞剂卡维地洛呈浓度依赖性抑制Kv2.1通道，延缓该通道的激活，加快灭活过程，并且Kv2.1通道外前庭的Y380和K356位点的突变能明显消除这种抑制作用[13]。本研究表明随着细胞膜去极化程度的增加，Kv2.1通道的激活加快，Kv2.1通道激活时间常数具有电压依赖性，并且Sp1减少了Kv2.1通道的激活时间常数，加快了该通道的激活过程。Kv2.1通道是失活相对较慢的一种钾离子通道。本研究发现当测试电压＞-60 mV，Kv2.1通道逐渐失活，当电压＞+20 mV时，该通道基本失活。Sp1干预后半失活最大电压和斜率因子无差异，表明Sp1未能影响Kv2.1通道的稳态失活性质。

已知心肌细胞膜表面钠、钾、钙等离子通道电流的异常改变是导致各种心律失常发生的最重要因素。Sp1作为基本转录因子，可通过调控离子通道变化，影响动作电位的发生，从而发挥抗心律失常作用。本研究通过对Sp1调控Kv2.1钾通道的探讨，为今后进一步研究心律失常发生的离子机制以及Sp1的调控作用，提供了有用的前期实验依据。