雷诺嗪对大鼠急性心肌梗死早期心室肌缝隙连接蛋白43的影响

郑展雄 张祥宇 江力勤 张冉

雷诺嗪（raolazine，Ran）为晚钠电流特异性阻滞剂，急性心肌缺血缺氧时可减少心肌细胞内钠离子浓度，减缓心肌细胞内钙超载，减轻心肌细胞损伤，为新型抗心绞痛药物。大量研究表明，Ran具有浓度依赖性多种离子通道电流阻滞效应，可抗快速性室性心律失常，但对影响心肌细胞电传导及小分子物质细胞间交换的缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）鲜有报道。本实验通过结扎大鼠冠状动脉左前降支制作大鼠急性心肌梗死模型，尾静脉注射Ran，观察Ran对急性心肌梗死早期心室肌Cx43的影响，并探讨可能机制。

1 材料和方法

1.1实验动物50只清洁级健康雄性SD大鼠，体重250～350 g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供[许可证号SCXK（苏）2001-0003]，实验动物相关操作符合浙江省实验动物管理办法要求。大鼠按随机数字表法分为5组，每组10只：假手术组，不结扎冠状动脉左前降支，注射0.9%氯化钠溶液2.5 mL/kg；对照组，结扎冠状动脉左前降支，注射0.9%氯化钠溶液2.5 mL/kg；Ran低浓度组、中浓度组及高浓度组，均结扎冠状动脉左前降支，分别注射Ran 0.05 mg/kg、0.5 mg/kg、5 mg/kg。

1.2试剂及仪器 雷诺嗪（美国Sigma公司，批号：093M4708V），Cx43一抗（美国Santa公司，批号：D0313），p-Cx43一抗（美国Santa公司，批号：12811），戊巴比妥钠（美国Sigma公司，批号：20141010），0.9%氯化钠溶液（杭州民生制药，批号：C1409252），肝素钠注射液（上海信宜制药，批号：110903），荧光抗体二抗试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司，批号：H120141008），Western blot免疫印记套装（上海哈灵生物科技有限公司，批号：017140yjj），膜蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司，批号：P0033）。精密手术器械一套（上海医疗器械厂），大鼠手术台，6/0缝线，小型动物呼吸机（成都泰盟软件有限公司，型号：HX-101E），BL-420/820生物机能实验系统（成都泰盟软件有限公司），台式小型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：5417R），组织高速分散器（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：XHF-D），蛋白电泳/转印系统（美国Bio-RaD公司，型号：Mini-PROTEAN Tetra Cell），全波长读数仪/酶标仪（美国Thermo Scientific公司，型号：Multiskan GO），正置荧光生物显微系统（德国Zeiss公司，型号：Axio Imager2），电子分析天平（瑞士Mettler-Tloledo公司，型号：MS403s/MS204s），脱色摇床（江苏金坛仪器厂，型号：TY-80B），-86℃超低温冰箱（中国海尔集团，批号：DW-86L388），-25℃医用冰箱（中国海尔集团，批号：DW-25W388）。

1.3方法

1.3.1 造模（1）麻醉：大鼠称重，3%戊巴比妥钠2.5 mL/kg腹腔注射，待大鼠腱反射消失后仰卧位固定，全身肝素化。（2）气管插管连接呼吸机：备毛，分离气管，从甲状软骨下气管软骨环切开气管，用自制内径2 mm、长5 cm的气管导管从环状软骨下2～3个软骨环下插入，深度1 cm。连接小动物呼吸机，潮气量6 mL/kg，频率80次/min，吸呼比1∶2。（3）结扎冠状动脉左前降支：常规消毒，每组分别尾静脉单次注射0.9%氯化钠溶液2.5 mL/kg、Ran 0.05 mg/kg、0.5 mg/kg、5 mg/kg，10 min后，连接大鼠肢体导联心电图，沿左锁骨中线纵行切开皮肤，在第4～5肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏。选择在左心耳和肺动脉圆锥之间，距离冠状动脉起始处2～3 mm，以6/0无损伤逢合针结扎冠状动脉左前降支；将心脏回纳入胸腔，闭合胸腔，观察心电图1～5 min，ST段明显抬高，为造模成功[1-2]。

1.3.2 多导生物机能系统记录大鼠心电图 自制电极插入大鼠四肢皮下，连接肢体导联电极，记录2 h内Ⅱ导联心电图，参数设置：纸速250 mm/s，增益10 Hz，电压0.05 V。用Lambeth规则分析心电图，采用steaer SE评分系统对2 h内快速性室性心律失常发生情况进行评分，测量各组2 h内Ⅱ导联心率、Tp-e间期、Q-Tc间期、Tp-e/Q-Tc比值。

1.3.3 免疫荧光染色和激光共聚焦扫描成像2 h后，处死大鼠，取心脏标本，每组随机取4个标本，取结扎处近端心室肌组织石蜡包埋，切片，厚度2μm，75℃烤箱放置1 h，二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。抗原修复液95～97℃水浴加热20 min。自然冷却后0.03%过氧化氢室温孵育30 min。蒸馏水冲洗1次，PBS冲洗5 min×3次。3%大牛血清封闭液（PBS稀释），室温20 min。滴加一抗（1∶200）。4℃过夜，37℃复温30 min，PBS冲洗5 min×3次。滴加荧光素标记的二抗（1∶200），37℃孵育1 h。PBS冲洗5 min×3次。抗猝灭胶封片，光镜下观察Cx43分布情况，红色荧光颗粒为Cx43表达阳性染色。每个标本连续取4张切片，每张切片随机选取6个视野，采用免疫荧光半定量法检测Cx43总表达量，观察Cx43细胞表面分布情况。采用Image J图像分析软件测定光密度值。

1.3.4 Western-Blot法检测心肌组织磷酸化Cx43（p-Cx43）含量 每组取6个标本，取冠状动脉左前降支结扎处近端心室肌组织心脏剪碎片；20 mg/200μL裂解液匀浆20 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液，BCA蛋白定量，100℃沸水煮沸5 min，冰上骤冷，3 000 r/min离心1 min。上样，电泳，200 mA恒流转膜70 min。5%BSA室温封闭2 h，TBST洗膜5 min×3次。加入封闭液稀释的p-Cx43（1∶200），GAPDH（1∶2 000），4℃孵育过夜。TBST洗膜5 min×3次，辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊二抗（1∶2 000）和HRP标记的羊抗大鼠二抗（1∶2 000）室温孵育2 h。TBST洗膜15 min×5次。化学发光检测试剂反应2 min。

1.4统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠快速性室性心律失常评分结果比较见表1。

表1各组大鼠快速性室性心律失常评分结果比较

由表1可见，对照组大鼠较假手术组心律失常评分升高，差异有统计学意义（P＜0.05），低浓度组、中浓度组、高浓度组大鼠较对照组心律失常评分降低，中浓度组、高浓度组大鼠较低浓度组心律失常评分降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2各组大鼠心率、Tp-e间期及Tp-e/Q-Tc间期比较 见表2。

由表2可见，假手术组大鼠心率较对照组加快，Tp-e/Q-Tc降低，Tp-e间期、Q-Tc间期缩短，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。对照组大鼠Tp-e/Q-Tc较假手术组、低浓度组、中浓度组、高浓度组升高（均P＜0.05），后3组之间差异亦有统计学意义（P＜0.05）；对照组大鼠Q-Tc间期较低浓度组、中浓度组、高浓度组降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但后3组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。2.3各组大鼠心肌组织p-Cx43/GAPDH、Cx43荧光半定量值及钙离子浓度比较 见表3、图1。

图1 p-Cx43电泳条带图

由表3、图1可见，对照组大鼠心肌组织p-Cx43/GAPDH、Cx43表达量与假手术组、低浓度组差异均无统计学意义（均P＞0.05），但较中浓度组、高浓度组降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；对照组大鼠心肌组织钙离子浓度较假手术组升高，差异有统计学意义（P＜0.05），与低浓度组比较差异无统计学意义（P＞0.05），中浓度组较低浓度组降低，高浓度组较中浓度组降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4各组大鼠心肌组织染色结果 见插页图2。

图2各组大鼠心肌组织染色图（A：假手术组，B：对照组，C：低度浓度组，D：中度浓度组，E：高度浓度组；HE染色，×40）

由图2可见，假手术组心室肌细胞排列整齐、无变性、无间质无水肿。对照组心室肌细胞空泡样变性、细胞核消失，细胞间排列紊乱、间质水肿、细胞间连接模糊不清或消失，部分细胞破裂。低浓度组心室肌细胞空泡样变性较对照组无明显改变、细胞核较对照组无明显改变；细胞间排列紊乱较对照组无明显改变，细胞间质水肿、连接模糊不清或消失较对照组无明显改变，细胞破裂化较对照组无明显改变。中浓度组心室肌细胞肿胀，无空泡样变性，心室肌细胞核完整，心肌细胞排列稍紊乱、细胞间质水肿较轻、心室肌细胞连接可见，心肌细胞无破裂。高浓度组心室肌细胞肿胀较对照组明显改变、细胞核完整，心肌细胞排列规则、间质轻度水肿。

表2各组大鼠心率、Tp-e/Q-Tc、Tp-e间期及Q-Tc间期比较

表3各组大鼠心肌组织p-Cx43/GAPDH、Cx43荧光半定量值及钙离子浓度比较

2.5各组大鼠梗死区心室肌Cx43细胞表面分布见插页图3。

图3各组大鼠梗死区心室肌Cx43表面分布（A：假手术组，B：对照组，C：低度浓度组，D：中度浓度组，E：高度浓度组；免疫荧光染色，×200）

由图3可见，假手术组心室肌Cx43分布在细胞端-端连接处，排列规则。对照组心室肌Cx43表达量较假手术组明显减少，细胞表面分布不均匀，较假手术组心室肌细胞侧面分布明显增多。低浓度组心室肌Cx43表达量较对照组未见差异，较假手术组明显减少，分散在细胞两侧，心室肌细胞端-端连接处分布较少。中浓度组心室肌Cx43表达量较假手术组减少，细胞表面分布不均匀，表达量较对照组明显上升。高浓度组心室肌Cx43表达量较假手术组减少，分布主要集中在细胞端-端，排列不规则，Cx43表达量较对照组、低浓度组明显上升。

3 讨论

NaV1.5是细胞表面主要的电-门控性钠离子通道蛋白，在闰盘处选择性存在，细胞缺血缺氧时，心肌细胞内钙离子浓度增加，氧化损伤加重，NaV1.5损伤加重。晚钠电流（late sodium current，INaL）主要存在于心室肌中层细胞，由Nav1.5通道蛋白介导，正常心室肌INaL只占钠电流（INa）的0.1%～1%。病理条件下INaL增加，舒张期Na+-Ca2+交换增加，内质网Ca2+释放，M细胞动作电位时程延长，产生迟后除极，导致严重的心律失常。Ran为INaL阻滞剂，在减轻心肌缺氧损伤的同时，可抗心律失常。

Pezhouman等[3]用特异性INaL通道阻滞剂阻滞心室肌INaL15min后室性心律失常的发生显著减少，阻滞剂消耗后快速性室性心律失常发生率增加。Samue等[4]在索他洛尔诱导的兔尖端扭转型室性心动过速模型中证实Ran对INaL阻滞效应具有浓度依赖性，低剂量时对兔离体心肌电生理影响不明显，高剂量明显延长心室肌动作电位时程，降低早后除极和尖端扭转型室性心动过速的发生率。本实验显示，低剂量Ran对急性心肌梗死大鼠的快速性室性心律失常评分无显著影响，中、高剂量Ran可明显降低快速性室性心律失常评分，提示Ran的抗心律失常作用可能与Ran的有效血药浓度相关。各组大鼠心率无显著差异，与大量实验报道的Ran对心率影响不显著相符。Ran干预后Q-Tc间期无明显变化，提示Ran不显著延长Q-Tc间期，但本实验观察到Tp-e间期、Tp-e/Q-Tc比值不同浓度Ran组较对照组降低，且效应与Ran浓度呈正相关。

Ran可特异性抑制病理条件下M细胞的INaL，抑制心肌细胞的Na+-Ca2+交换，减缓心肌细胞缺氧时细胞内Ca2+浓度，减轻心肌细胞内钙超载。本实验显示梗死区心室肌细胞内钙离子浓度增加，高、中浓度组心肌细胞内钙离子浓度降低，可能与Ran有效抑制INaL，降低心肌组织钙离子浓度相关[5]。

大鼠心室肌主要表达Cx43，半衰期为1～1.5 h，主要分布于心室肌细胞之间的闰盘处，呈条带状规则排列，在心肌细胞膜侧面分布极少。病理条件下Cx43发生异质性，表现为Cx43表达降低、去磷酸化、细胞表面排列非均匀化、侧面化。Cx43表达降低合并细胞表面分部非均匀化，可导致心肌组织间电传导的各向异性，降低心肌细胞间电传导速度，Cx43去磷酸化后活性降低，细胞间电传导速度降低。Sato等[6]研究证实Cx43重构可通过导致心肌动作电位时程的变化、各向异性传导、传导的减慢等，增加心律失常易感性。我们在前期实验中证实，胺碘酮联合Ran对急性心肌梗死大鼠心室肌细胞起到一定的电稳定作用[7]。Indra等[8]通过转染Cx43E42K基因到健康小鼠胚胎，制作小鼠无功能性表达Cx43猝死模型，观察到胚胎期Cx43+/E42K小鼠心室肌电生理易被干扰，未观察到胚胎的结构缺陷，但胚胎易死亡。Cx43和NaV1.5均为细胞膜表面的重要蛋白。Agullo-Pascual等[9]的研究提示钠离子通道蛋白在细胞膜表面的分布依赖Cx43，Cx43和Nav1.5在细胞表面通过桥粒连接相互作用。Wang等[10]采用具有稳定微管蛋白作用的紫杉醇干预心肌缺血再灌注的大鼠模型，发现紫杉醇可以显著增加Cx43的表达，减少侧面化，减少动作电位时程，减少缺血性室性心律失常的发生。Zhang等[11]敲除心房肌细胞（HL-1细胞）表面桥粒基因后Cx43/Nav1.5表达量降低，钠离子电流减少，HL-1细胞的传导电压降低，致命性心律失常发生率降低。Waring等[12]敲除Cx43基因导致钠离子电流的减少与Nav1.5的减少呈正相关，重新导入羧基端基因或敲除301位到361位之间的氨基酸序列后钠离子电流恢复。证实Cx43与钠离子电流密切相关。Luqia等[13]用Kir2.1、NaV1.5和Cx43基因编码的病毒转染心脏纤维母细胞后心脏纤维母细胞具有产生和传播动作电位的能力。

本实验显示，与假手术组相比，对照组Cx43、p-Cx43表达量明显下降，Ran干预后表达量较对照组上升，表明Ran对Cx43、p-Cx43具有保护作用，可延缓Cx43、p-Cx43的降解；Ran对Cx43细胞表面分布侧面化具有延缓作用，这种作用与Ran浓度呈正相关。Ran减缓Cx43的降解，降低Cx43侧面化程度，降低Cx43磷酸化，可能与Ran阻滞INaL，降低心肌细胞内钙离子浓度，稳定Nav1.5蛋白，稳定Cx43和NaV1.5连接相关。具体机制还有待进一步实验探究。