湿性年龄相关性黄斑变性患者血清miR-9和miR-146a表达水平及意义

李红月

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是由于黄斑区视网膜因衰老发生病变的一种慢性病变性疾病，多发于老年人，是导致老年人眼盲的主要原因之一。流行病学研究表明，52～64岁老年人发生AMD的比例约1.5%，75～85岁发病率则高至27.9%，已成为我国致盲的第三大类疾病[1]。AMD分为干性AMD和湿性AMD，其中湿性AMD(wet AMD，wAMD)临床多表现为眼底视网膜上皮剥落、发生纤维化，脉络膜出现新生血管等病理变化[2]，然而其发病机制尚不清楚。有研究表明，病理性血管生成、炎性反应、氧化应激等在wAMD疾病发生中具有重要作用[3]。研究表明，不同种类微小RNAs(Micro RNAs，miRNAs)对以上生物过程分别具有调控作用，另外随着分子生物学的进步，许多miRNA被发现可应用于临床疾病的诊断和治疗[4,5]。因此，本研究通过检测wAMD患者血清中miR-9、miR-146a表达情况，并分析二者与患者临床特征、血清炎症反应和血管内皮生长因子水平的相关性，旨在揭示血清miR-9、miR-146a表达在wAMD发生发展中作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年3月至2017年6月在我院眼科诊治的wAMD患者87例(105眼)为研究对象(wAMD组)，其中男60例，女27例；年龄50～83岁，平均年龄(65.32±8.95)岁；患者均行眼压等一般常规检查、眼底荧光素血管造影(fluorescein fundus angiography，FFA)、光学相干断层扫描成像术(Optical coherence tomography，OCT)等检查以明确患者眼睛病变情况，根据上述检查结果，参照wAMD疾病诊断标准进行诊断[6]。选取同期无眼部疾病体检者85例为对照组，其中男59例，女26例；年龄50～85岁，平均年龄(65.78±9.71)岁。2组受试者年龄、性别比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院道德伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①经专业眼科医师确诊单侧眼或双侧眼符合wAMD诊断标标准；②年龄50～83岁；③临床一般资料和病理资料完整；④入院治疗前1个月内未参加其他临床项目试验；⑤明确本研究内容并自愿加入本次研究，且依从性良好。

1.2.2 排除标准：①合并糖尿病视网膜疾病、黄斑裂孔、高度近视等眼睛底部疾病患者；②眼底病症不清晰患者；③哺乳和妊娠期患者；④其他可能引起视网膜及黄斑病变的疾病患者；⑤有荧光素钠针过敏患者；⑥治疗前1月内患有肝病、高血压、严重炎症等疾病患者。

1.3 研究方法

1.3.1 一般资料及指标采集:采集wAMD患者年龄、性别等，进行眼部常规检查、FFA及OCT等检查，记录患者眼压、视网膜下出血情况、眼底荧光素渗透情况及脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)情况。按照CNV形态分为：①典型性：边界清晰；②隐匿性：边界模糊。

1.3.2 血清采集及指标检测:分别于体检当天和入院12 h内采集体检者和wAMD患者肘静脉血(4 ml/人)，置于抗凝真空管中，分离血清。采用自动酶标仪(美国宝特公司)通过人C-反应蛋白(C reactive protein，CRP)酶联免疫吸附试剂(武汉艾美捷科技公司)和人血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)酶联免疫吸附试剂(武汉华美生物公司)测定各受试者血清中CRP和VEGF水平；以U6作为内参，采用实时荧光定量(real-time fluorescence quantitative，qRT)-PCR技术检测并分析血清中miR-9、miR-146a相对表达水平。

2 结果

2.1 2组血清miR-9、miR-146a表达比较 与对照组比较，wAMD患者血清miR-9、miR-146a相对表达量均明显增高(P<0.05)。见表1。

表1 2组血清miR-9、miR-146a表达水平比较

2.2 血清miR-9、miR-146a水平与wAMD患者临床参数的关系 不同性别、年龄、吸烟、饮酒、病变眼数及视网膜下出血情况的wAMD患者血清中miR-9、miR-146a表达水平差异无统计学意义(P<0.05)。有眼底荧光渗透的wAMD患者血清中miR-9、miR-146a水平显著高于无眼底渗透患者(P<0.05)；眼压>21 mm Hg的wAMD患者血清中miR-9、miR-146a水平显著高于眼压为10～21 mm Hg患者(P<0.05)；典型性CNV的wAMD患者血清中miR-9、miR-146a水平显著高于隐匿性CNV患者(P<0.05)。见表2。

2.3 2组血清VEGF、CRP水平比较 与对照组比较，wAMD患者血清VEGF、CRP水平均明显增高(P<0.05)。见表3。

2.4 wAMD患者血清miR-9、miR-146a、VEGF、CRP水平的相关性 Pearson检验结果表明，wAMD患者血清miR-9水平与miR-146a、VEGF水平呈正相关(P<0.05)、与CRP无明显相关(P>0.05)；miR-146a水平与CRP水平呈正相关(P<0.05)，与VEGF水平无明显相关(P>0.05)；VEGF水平与CRP水平无明显相关(P>0.05)。见表4。

2.5 血清miR-9、miR-146a水平诊断wAMD疾病的临床价值 ROC分析结果显示，miR-9对wAMD疾病诊断的AUC为0.634(95%CI：0.495～0.773，P<0.05)，miR-9/U6≥3.67诊断wAMD疾病的敏感性为54.53%，特异性为90.86%；miR-146a对wAMD疾病诊断的AUC为0.774(95%CI：0.662～0.885，P<0.05)，miR-146a/U6≥4.25诊断wAMD疾病的敏感性为69.81%，特异性为77.69%。见图1。

表2 血清中miR-9、miR-146a水平与wAMD患者临床参数关系

表3 2组血清VEGF、CRP水平比较

表4 wAMD患者血清miR-9、miR-146a、VEGF、CRP水平的相关性分析

图1 ROC分析血清miR-9、miR-146a水平诊断wAMD疾病的价值

3 讨论

wAMD是一种视网膜色素上皮层代谢障碍导致黄斑部视网膜退行性疾病。随着生活水平的逐渐提高，我国人口老龄化水平增加，wAMD发病率随之逐年增加[7]。因此探究wAMD疾病发生机制，寻找能反应wAMD疾病发生的生物指标对尽早筛查出wAMD患者，以尽早干预、采取有效治疗措施具有重要意义。

miRNAs可通过与靶基因mRNA3’非编码区特异性结合，调节靶标基因转录表达，参与调控免疫反应、氧化应激及血管生成等生物学过程[8]。miRNA的异常表达在包括AMD等多种疾病中作为重要调节因子参与疾病发生。miRNA分子量小，可通过细胞膜释放进入循环系统，均匀分布在血清或血浆中，相对稳定且易于收集和检测[9]。基于上述特征，血清miRNA可作为诊断疾病的可能生物标志物，应用前景良好。然而，目前关于wAMD患者血清miRNA表达模式的研究相对较少。

miR-9是一类哺乳动物常见的miRNA之一，存在于多种细胞、组织中，参与视网膜祖细胞的增殖分化[10]。Liu等[11]研究表明，发生炎症的视网膜小胶质细胞中miR-9表达显著上调，氢气治疗可显著下调miR-9表达，降低LPS诱导的细胞炎症，提示miR-9在视网膜炎症中发挥作用。Yoon等[12]发现，miR-9可能作为治疗新血管病理疾病的潜在靶点。本研究发现，与对照组比较，wAMD患者血清miR-9水平显著上调，与Romano等[13]发现一致，表明miR-9表达上调可能参与wAMD疾病发生。本研究发现有眼底荧光渗透、眼压>21 mm Hg、典型性CNV的wAMD患者血清中miR-9水平显著高于无眼底荧光渗透、眼压10～21 mm Hg、隐匿性CNV患者，眼底荧光渗透情况是眼底渗出情况的反映，与疾病严重程有关，表明血清miR-9水平与wAMD疾病严重程度有关。另外，Zhuang等[14]研究发现，采用携带有miR-146a慢病毒注射糖尿病视网膜病变大鼠，可显著增加视网膜中miR-146a表达，降低炎性因子表达，改善模型大鼠微血管渗透情况和视网膜功能缺陷，提示miR-146a可能作为治疗视网膜病变的潜在靶标。本研究发现，与对照组比较，wAMD患者血清miR-146a水平显著上调，与Pogue等[15]在AMD疾病中发现一致，表明miR-146a表达上调可能参与wAMD疾病发生。进一步研究法发现血清中miR-146a水平与wAMD患者眼底荧光渗透情况、眼压、CNV类型有关，表明血清miR-146a水平与wAMD疾病严重程度有关。

研究表明，脉络膜血管异常生长引起CNV发生，是导致wAMD患者失明的主要因素，其发生与血管内皮生长因子(VEGF)表达异常相关[16]。本研究发现，与对照组比较，wAMD患者血清中VEGF和CRP水平均明显增高。进一步研究提示wAMD患者血清miR-9水平与VEGF水平正相关，提示miR-9可能通过调控VEGF表达，参与调控视网膜脉络膜新生血管生成。Kutty等[17]研究表明，视网膜色素上皮细胞转染miR-146a mimics后，细胞中促炎细胞因子水平明显增高，提示miR-146a在炎症引起的视网膜病变中发挥调控作用。Cowan等[18]发现，采用miR-146a mimics处理人视网膜内皮细胞，可通过调节NF-κB通路调节白介素等炎性因子表达，诱导炎性发生。以上研究提示，miR-146a可通过调控炎性反应参与视网膜病变过程。本研究结果显示，wAMD患者血清miR-146a水平与CRP水平正相关，提示miR-146a可能通过调节CRP表达，调节视网膜组织炎性反应，参与wAMD疾病发生。ROC分析发现，miR-9对wAMD疾病诊断的AUC为0.634，miR-146a对wAMD疾病诊断的AUC为0.774，表明miR-9、miR-146a对健康者和wAMD患者有较强区分能力。

综上所述，wAMD患者血清miR-9、miR146a表达上调，与患者眼底荧光渗透情况、眼压、CNV类型、CRP水平和VEGF水平有关，提示血清miR-9、miR146a水平上调参与wAMD疾病发生发展。