复方斑蝥通过miR-520d/Beclin1信号轴逆转三阴乳腺癌化疗耐药的机制研究＊

李红昌，刘维燕，王建法，潘高峰，陆景锋，刘嘉哲，胡丽萍

（上海市闵行区中心医院普外科 上海 201100）

三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体（HER-2）均为阴性的一类乳腺癌，约占所有乳腺癌病理类型的15%，其预后差、复发转移率高、死亡率高。由于TNBC 的内分泌治疗效果不佳，化疗为其重要治疗手段，目前常用化疗药物包括紫杉类（紫杉醇，多西紫杉醇又名多西他赛，白蛋白合成紫杉醇)，蒽环类（阿霉素、表阿霉素，各类脂质体阿霉素），抗代谢类（卡培他滨、吉西他滨）。TNBC 容易对化疗药物产生耐药性，严重影响疗效[1]。近年研究发现，临床化疗药物多西他赛（Docetaxel，Doc）长期应用可以诱导TNBC 细胞自噬水平异常升高，进而诱导细胞耐药，而降低细胞自噬水平可以增强肿瘤细胞对多西他赛的敏感性[2]。miRNA 是一类长度为19-25nt 的非编码单链小分子，可以与其靶基因的mRNA 3′非编码区（3′UTR）特异性结合，抑制靶基因表达。近年来关于非编码RNA 如miRNA 在调控肿瘤自噬过程中的作用研究越来越受到重视。研究显示miRNA 可以通过调控细胞自噬水平进而影响肿瘤细胞的耐药[3]。

中医药治疗对乳腺癌术后并发症及减轻乳腺癌放化疗毒副反应有着重要的临床意义。其中，复方斑蝥注射液（Compound Cantharis Injection，CCI），又名艾迪注射液，是临床上TNBC 常用的化疗辅助药物[4]，目前关于复方斑蝥抑制自噬抗TNBC 耐药的机制尚未见报道。因此，本研究观察复方斑蝥逆转三阴乳腺癌耐药的药理学作用并探讨miRNA-自噬信号轴是否是CCI逆转三阴乳腺癌耐药的关键机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

RPMI1640 培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；多西他赛（Docetaxel，Doc）购自美国MedChemExpress 公司；TRIzol 试剂、TaqMan miRNA 反转录试剂盒、TaqMan miRNA 定量PCR 试剂盒和Lipofectamine 2000 转染试剂盒购自美国ThermoFisher公司；TaKaRa 6210A反转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa 公司；miR-520d mimics 及inhibitors 购自美国Qiagen 公司；pGL3-Beclin1/BECN13′UTR-promotor 重组质粒构建由上海基科生物有限公司设计完成；Beclin1/BECN1 及LC3 抗体购自英国Abcam 公司；辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）标记的山羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司。PCR 扩增仪购自美国Applied Biosystems公司，电泳仪、转膜仪和凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养

人三阴性乳腺癌MDA-MB-231 及MDA-MB-468细胞株购自美国标准细胞库（American type culture collections，ATCC），相应的多西他赛（Docetaxel, Doc）耐药株MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 诱导于本实验室。均培养于10%小牛血清的RPMI 1640培养基，及37℃并含有5% CO2培养环境。为了保持耐药株MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 的耐药表型，多西他赛（终浓度为2 μM）始终加在耐药细胞的培养基中，实验前一周停止加药。

1.3 MTT法检测细胞活性

8 × 103cell/well 密 度 的MDA-MB-231 及MDAMB-468、MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 细胞接种到96孔板。到细胞完全贴壁后，加入不同浓度的多西他赛，置37℃，5% CO2的培养箱培养。48 小时后每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，4 小时后吸弃上清，加入100 μL/孔的DMSO，振荡1 min。待MTT 还原产物溶解完全后，以492 nm 为实验波长，630 nm 为参照波长运用酶标仪检测其光吸收度。通过计算细胞的存活率，并确定药物的IC50。

1.4 Western blot检测蛋白表达

用RIPA 裂解液提取各组细胞蛋白。用BCA 试剂盒检测各组总蛋白浓度，调平蛋白浓度后，取等量蛋白用10%SDS-PAGE 分离蛋白，湿转法转移蛋白至PVDF 膜。5%脱脂牛奶室温封闭PVDF 膜1 h，随后加入一抗，4℃封闭过夜，第2天弃去一抗，加入HRP标记的山羊抗兔二抗室温封闭1 h，滴加显色液显色，用凝胶成像系统获取蛋白质条带图片。

1.5 miRNA芯片分析

首先运用Trizol 法抽提取终浓度1 mg·ml-1复方斑蝥及溶剂组处理的MDA-MB-231/Doc细胞中总RNA。随后进一步使用mirVanaTM 的miRNA 分离试剂盒（购买于Ambion公司）纯化总RNA中的miRNA部分，最后将提取好的miRNA 样品送至上海生物芯片中心进行芯片分析，使用安捷伦公司的人miRNA 芯片（v.12.0）进行杂交。

1.6 实时定量PCR（RealtimePCR）检验miRNA表达

运用Trizol 从培养的细胞中提取总RNA，用TaqMan miRNA 反转录试剂盒进行逆转录，每条miRNA 的相对量均以细胞中U6 snRNA 的含量为标准，用PCR 进行扩增，根据试剂盒说明书用TaqMan miRNA 定量PCR 试剂盒或实时定量PCR 试剂盒进行定量分析。实验所用到的引物均由上海生工设计合成。所以数据均平行3次取平均值。

1.7 荧光素酶报告实验

通过生物信息预测miR-520d 上存在Beclin1/BECN1 的结合位点，用RT-PCR 扩增Beclin1/BECN1上含有miR-520d 结合位点的3′UTR 区域基因片段，将该片段插入pGL3-promoter 荧光素酶载体，构建Beclin1/BECN13′UTR 野生（wild type，WT）质粒；再利用基因位点突变技术对结合位点的部分核苷酸进行突变，构建Beclin1/BECN13′UTR 突变（Mutation，Mut）质粒。用Beclin1/BECN13′UTR WT 质粒或Beclin1/BECN13′UTR Mut质粒，海肾荧光素酶对照质粒pRLSV40 与miR-520d mimics 对MDA-MB-231/Doc 细 胞进行共转染，根据Dual Luciferase 报告基因试剂盒说明书避光测定荧光素酶活性。

图1 自噬相关蛋白Beclin1/BECN1在TNBC耐药细胞中表达增高

图2 复方斑蝥通过抑制自噬逆转TNBC化疗耐药

1.8 统计学方法

用SPSS 24.0 对实验数据进行统计分析，用GraphPad Prism 8 软件绘制图片。实验结果用均数±标准差表示，组间差异用One-Way ANOVA 检测。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自噬相关蛋白Beclin1/BECN1 在TNBC 化疗耐药细胞中表达增高

运用MTT 法检测TNBC 细胞MDA-MB-231 及MDA-MB-468 及 其 耐 药 株MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 对于Doc 的敏感性。结果显示，对于MDA-MB-231的半数抑制浓度（IC50）为4.5 μM，相比于其耐药株（IC50 =45 μM）具有显著性差异，表明MDA-MB-231/Doc 具有良好的耐药性；同样，MDAMB-468 的耐药株MDA-MB-468/Doc 也具有良好的耐药性（图1A）。WB 检测结果发现，相对于亲本株，TNBC 耐药细胞株（MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc）中自噬相关蛋白Beclin1/BECN1 表达明显上升（图1B），提示Beclin1/BECN1的高表达可能是TNBC耐药细胞株产生耐药的主要原因之一，也进一步验证了临床化疗药物多西他赛长期应用可以诱导TNBC 细胞自噬水平异常升高，进而诱导细胞耐药的这一研究结果。（图1）

2.2 复方斑蝥通过抑制自噬逆转TNBC化疗耐药

MTT 检测Doc 和CCI 联合使用多TNBC 耐药细胞株的增殖影响，结果发现，CCI 能够显著降低Doc 作用下耐药细胞株的IC50（图2A），提高TNBC 耐药细胞株化疗敏感性，提示复方斑蝥具有逆转TNBC 化疗耐药的能力。随后运用免疫印迹法（Western bloting，WB）发现，CCI能够浓度依赖性的抑制TNBC耐药细胞的自噬水平，明显下调自噬相关蛋白Beclin1/BECN1，及自噬水平标注蛋白LC3II（图2B），表明复方斑蝥通过抑制自噬逆转三阴乳腺癌化疗耐药，提高对于多西他赛的药物敏感性。

2.3 复方斑蝥上调miR-520d的表达

近年来关于miRNA 在调控肿瘤自噬过程中的作用越来越受到重视，为了进一步探究miRNA 是否在复方斑蝥逆转TNBC 耐药起到关键的作用，我们对CCI处理前后的TNBC 耐药细胞采用miRNA 芯片检测，发现CCI 能够显著上调miR-520d 水平（图3A&B），RealtimePCR 在MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc中验证这一结果（图3C）。上述结果提示CCI上调的miR-520d 可能在复方斑蝥抑制TNBC 耐药细胞自噬过程中发挥作用。

图3 芯片结果显示复方斑蝥上调TNBC耐药细胞中miR-520d的表达

2.4 MiR-520d 通过作用于Beclin1/BECN13′ UTR 区域抑制其表达

通过生物信息学软件预测发现Beclin1/BECN1 是miR-520d 潜在的靶点，生物信息学分析发现miR-520d 在Beclin1/BECN1 的3′UTR 含 有1个 作 用 位 点（图4A）。运用双荧光素酶报告基因法检测miR-520d在Beclin1/BECN1 的3′UTR 的结合作用，将构建的质粒及miR-520d 模拟物（mimics）共转染进入MDAMB-231/Doc 细胞中。图4B 显示miR-520d 可以明显抑制荧光活性的强度，这表明，miR-520d 能够抑制Beclin1/BECN13′UTR 区域活性。同时在没有含有结合位点的质粒组中，荧光活性没有受到抑制，这表明miR-520d 抑制Beclin1/BECN1 的位点仅有所预测的这个结合位点。最后，WB 结果显示miR-520d mimics能够明显抑制TNBC 耐药细胞株（MDA-MB-231/Doc及MDA-MB-468/Doc）中Beclin1/BECN1 的蛋白表达。综上，miR-520d 通过作用于Beclin1/BECN13′UTR 区域的位点进而抑制Beclin1/BECN1的表达。

2.5 MiR-520d 在复方斑蝥逆转TNBC 化疗耐药过程中起到关键作用

运用MTT法检测miR-520d在CCI逆转TNBC化疗耐药过程中的作用。结果显示miR-520d mimics 能够显著提高TNBC耐药性细胞对于多西他赛的敏感性（图5A&C）；相反，如果运用miR-520d抑制剂（inhibitor）抑制miR-520d的水平能够明显减弱CCI所促进的TNBC耐药性细胞对于DOC的敏感性。

图5 复方斑蝥通过调节MiR-520d的表达逆转TNBC化疗耐药

3 讨论

中医在乳腺癌的辨证论治方面有着独特的优势，中医学认为乳腺癌系情志失调，肝气郁结，经络痞塞，气机阻滞，痰浊、瘀血内生，郁久化热成毒，或冲任失调，气血亏损，痰浊内生，阻滞气机血行，久而成积[5]。病机错综复杂，但以痰瘀阻络、化热成毒为主要病机，正气虚弱是乳腺癌复发转移的基础，毒痰瘀结是乳房癌复发转移的关键因素。因此，从毒痰瘀虚论治三阴乳腺癌是预防复发转移的中药治疗方法[6]。中医药治疗对乳腺癌术后并发症及减轻乳腺癌放化疗毒副反应有着重要的临床意义。其中，CCI 是临床上三阴乳腺癌常用的化疗辅助药物。CCI 是由斑蝥、人参、黄芪、刺五加组成，是现代组方的纯中药制剂。方中以祛邪为主要作用的斑蝥为君药，斑蝥体内含有斑蝥素，是抗肿瘤的主要活性成分；具有扶正为主要作用的人参、黄芪共为臣药；为增强参芪扶正之功，配以刺五加为佐使之药。该药具有破血消瘀、清热解毒、攻毒蚀疮、扶正固本功效，可提高免疫力，激活抑癌基因，杀死癌细胞，对化疗有协同和辅助作用。CCI主要成分斑蝥有直接杀伤肿瘤细胞的作用，斑蝥提取物的抗肿瘤活性成分为去甲斑蝥素，它对乳腺癌细胞均有抑制作用[7]，还具有抗癌而不产生骨髓抑制的特点，能对抗放化疗中血细胞下降。临床观察表明，复方斑蝥对三阴乳腺癌有一定疗效，能有效预防术后复发和转移[8]。现代医学研究证实，CCI可通过多途径多靶点对恶性肿瘤起到治疗作用：①干扰肿瘤细胞的DNA 和RNA 的生物合成，直接杀伤肿瘤细胞；②抑制癌基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡；③抑制肿瘤血管新生；④逆转多药耐药；⑤保护骨髓；⑥调节免疫，增强淋巴因子激活性杀伤细胞、自然杀伤细胞活性等[9]。其中，逆转耐药是CCI 抗肿瘤的作用机制之一，本研究进一步明确了其具体逆转耐药机制。

细胞自噬的进程主要受自噬相关基因调控，Beclinl是自噬激活/启动的一个标志蛋白，通过与不同自噬相关蛋白结合形成复合物，参与调控自噬体的形成和成熟。在自噬过程中，Beclin1的表达水平往往会上升[10]。在肿瘤细胞中Beclin1 可以通过调控自噬参与肿瘤细胞耐药发生。研究发现，Doc 诱发细胞内质网应激，轻微应激可促进应激活化信号分子c-Jun 氨基末端激酶-1 介导的Bcl-2 的磷酸化，进而导致Beclin1 的释放促进自噬发生，同时释放的Beclin1 可与Bax结合抑制凋亡，使得肿瘤细胞拮抗凋亡，最终导致肿瘤耐药[11]。研究证实，在乳腺癌细胞中降低Beclin1 表达水平可提高其化疗敏感性。因此，探讨Beclin1 表达调节机制对乳腺癌化疗耐药这一临床难题有极其重要的意义。

本研究应用构建的三阴性乳腺癌Doc耐药细胞株进行化疗药物半数抑制浓度检测，发现三阴性乳腺癌多西他赛耐药细胞株相对其亲本细胞株半数抑制浓度明显上升，自噬相关蛋白Beclin1/BECN1 表达增高，而复方斑蝥处理后能明显增加多西他赛的敏感性，显著降低多西他赛半数抑制浓度，并且抑制自噬标志蛋白Beclin1/BECN1 及LC3II 的表达，提示复方斑蝥可能是通过抑制三阴性乳腺癌耐药细胞的过度自噬逆转其耐药作用。

随着miRNA 在调控肿瘤自噬过程中的作用研究越来越受到重视[12]，此类研究日趋丰富。研究显示，miRNAs 可以通过调控自噬相关基因转录后表达水平，进而调控细胞自噬水平。如外泌体miRNA-126通过破坏IRS/Glut-4 信号传导重塑代谢，激活AMPK/自噬途径并稳定即将产生的脂肪细胞中的HIF1α表达。体内抑制miRNA-126 可以减少脂肪细胞诱导的肿瘤生长[13]。在MCF-7 乳腺细胞系中，miR-486-5p 抑制剂诱导自噬并通过增加PTEN 表达和抑制AKT信号传导来增强AdoMet 诱导的自噬过程，从而促进MCF-7凋亡[14]。同时，有研究表明，miR-224-5p 通过靶向MDA-MB-231 细胞中的Smad4 抑制自噬，miR-224-5p/Smad4-自噬信号轴可能是乳腺癌治疗的新靶点[15]。此外，在TNBC 中，miR-20a 介导的自噬缺陷可能是乳腺肿瘤发生过程中miRNA 致癌功能的新机制[16]。小分子miR-376a 可以通过抑制ATG4B 和Beclin1 表达而抑制MCF-7 细胞和Huh-7 细胞因饥饿诱导的自噬[17]。进一步检索发现，miRNA 可以通过调控细胞自噬水平进而影响肿瘤细胞的耐药，如miR-181 不仅可以抑制乳腺癌MCF-7细胞本底的自噬水平，而且抑制药物如依托泊苷和雷帕霉素诱导的自噬，进一步逆转耐药[18]。在乳腺癌中，miR-214 通过抑制自噬从而增强乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性[19]。具有自噬调节功能miR-129-5P 可以通过与Beclin1 基因3'UTR 序列结合下调后者表达，进而发挥其抑制多种肿瘤细胞如乳腺癌、肺癌等细胞自噬的作用[20]。

为了进一步探究复方斑蝥逆转三阴性乳腺癌耐药的分子机制，我们对复方斑蝥处理前后的三阴性乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/Doc 进行microRNA 芯片检测，发现复方斑蝥能够显著上调miR-520d 水平，RealtimePCR 也验证了这一结果；通过生物信息学软件预测发现Beclin1/BECN1 是miR-520d 潜在的靶点。有研究发现，miR-520d可能是诊断乳腺癌的一个特异性生物标志物，其在乳腺癌中高表达，尤其是HER-2阴性的乳腺癌[21]。近几年来，miR-520d 与肿瘤的关系也逐渐被重视[22]，miR-520d 通过下调EphA2 的表达能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[23]；研究发现，在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 中，过表达miR-520d，可以减弱细胞的增殖和迁移[24]。因此随后通过双荧光素酶报告基因方法，我们确认miR-520d 能够结 合 到Beclin1/BECN1 mRNA 的3′UTR 区 域，并 且miR-520d 能够显著抑制三阴性乳腺癌耐药细胞中Beclin1/BECN1蛋白水平的表达。最后通过转染miR-520d 的模拟物及抑制剂进入三阴性乳腺癌耐药细胞中，结果显示miR-520d 模拟物能够显著增加多西他赛对于耐药细胞的敏感性，反之，miR-520d 的抑制剂能显著抑制复方斑蝥逆转三阴性乳腺癌耐药细胞耐药的作用。这些结果明确了miR-520d/Beclin1信号轴是复方斑蝥逆转三阴乳腺癌化疗耐药的主要机制。

总之，本实验结果表明复方斑蝥通过上调三阴性乳腺癌耐药细胞miR-520d 的表达，靶向Beclin1/BECN1 抑制三阴乳腺癌化疗耐药过程中过度自噬，从而增加三阴乳腺癌耐药细胞对于化疗药物多西他赛的药物敏感性，逆转三阴乳腺癌化疗耐药。本课题的研究有助于阐明复方斑蝥、自噬、耐药之间的内在联系，进一步了解三阴乳腺癌的化疗耐药机制，为临床上以复方斑蝥作为辅助联合用药治疗三阴乳腺癌提供实验依据。