基于网络药理学研究白及治疗肺癌的潜在靶标及作用机制＊

敖卓君，张云帆，洪佳娜，肖 雪，李莎莎，严诗楷，3

（1. 广东药科大学中医药研究院 广州 510006；2. 广州中医药大学第二临床医学院 广州 510006；3. 上海交通大学药学院 上海 200240）

白及又名白芨，为兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥块茎，其性味苦、甘、涩，微寒，入肺经。具有补肺，止血，消肿，生肌，敛疮的功效，主治肺伤咳血，衄血，金疮出血，溃疡疼痛等疾病[1]。现代药理学研究表明，白及具有抗菌、止血、抗肿瘤、抗溃疡、抗纤维化、促进伤口愈合等药理活性，临床常用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、妇科肌瘤、肿瘤栓塞等病症[2]。白及素有“血家圣药、肺科良药”的美称，为中医临床治疗肺部疾病的首选要药[3]。

肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[4]，包括非小细胞癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞癌（small cell lung cancer，SCLC），前者发病率高达80%且呈逐年升高趋势[5,6]。目前的治疗方法仍以单一或联合化疗、靶向治疗等手段为主。化疗可以杀灭体内癌细胞,也可以杀灭体内正常细胞，如骨髓细胞、头发毛囊细胞，副作用极大。而靶向治疗专门打击特异性的肿瘤细胞，副作用大大减少，但仍可出现皮疹、恶心、呕吐、腹泻、用药后的疲惫感等副作用。中医药在肿瘤多靶点综合治疗中具有独特的疗效优势，且副作用小，已被联合用于晚期癌症二、三线化疗后患者的治疗[7]。临床上白及常与白花蛇舌草、半枝莲等中药配合用于抗肺癌治疗中[8]，具有良好的应用前景。现代研究表明，白及对肺癌细胞具有明显的抑制作用[3，9]，但其潜在靶标及作用机制尚不明确。

网络药理学利用网络拓扑结构分析及生物信息学方法来解释药物、靶标、信号通路与疾病之间的复杂关系，为中药复方作用机理的研究及临床应用提供了新思路[10]，是新药开发设计的一种新方法。本文将这一技术应用于预测白及治疗肺癌的靶标及其信号通路，探讨其多靶标、多途径的调控机制。本研究将为白及进一步的基础实验、临床研究以及新药开发等提供科学依据，为肺癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 化学成分收集与筛选

在中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[11]及中医百科全书ETCM数据库（http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/）[12]中检索“白及”，获得白及化学成分。为了不遗漏可能的有效成分，应用OB/DL 值和Lipinski 五规则两种方法对成分进行虚拟筛选并对筛选结果进行合并去重。OB值和DL值是药物成分筛选的常用参数[13]，根据口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18筛选白及活性成分并收集成分作用靶标。Lipinski 五规则包括相对分子量小于500、脂水分配系数（ClogP）小于5、氢键给体数目小于5、氢键受体数目小于10、化合物中可旋转键的数量小于10，符合此规则的化合物往往具有较好的生物利用度和药动学性质。但此规则实际应用上具有局限性，为了尽量减少漏筛, 本研究基于前三项进行筛选[14]。

1.2 活性成分作用靶标筛选

利用Uniprot（http://www.uniprot.org/）数据库将白及活性成分作用靶蛋白转换为相应基因名，在Excel表格中对相同基因靶点进行去重，删除uniprot 里搜寻不到的靶蛋白。在Pubchem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）中搜索成分的SMILES 号，通过Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）在线工具进行靶标预测，设置为Homo sapiens[15]，筛选可能性排前的15个靶标作为候选靶标，整合TCMSP、ETCM数据库中获得的靶标。

1.3 疾病靶标预测

GeneCards 数据库（http://www.genecards.org/）包含了丰富的疾病相关靶标信息，是常用的疾病靶标预测工具[16]。在数据库中以“Lung Cancer”为关键词检索得到肺癌疾病相关基因，作为候选靶标基因。

1.4 成分-潜在靶标蛋白互作网络图构建

将白及活性成分和相应作用靶标按照不同类别导入Cytoscape3.7.0软件中，构建“白及活性成分-作用靶标”网络；利用Cytoscape中的STRING插件构建肺癌靶标“蛋白质相互作用（PPI）”网络；使用Merge 功能取上述网络的并集，获得白及与肺癌的共同靶标，构建“活性成分-共同靶标蛋白互作”网络。

1.5 GO功能富集与KEGG通路富集分析

将共同靶标同时导入Metascape 生物分子功能注释系统（www.metascape.org/）进行GO 基因本体功能和KEGG 通路富集分析，设置P Value Cutoff 为0.01，选择生物过程（Biological Processes）、分子功能（Molecular Functions）、细胞组成（Cellular Components）、KEGG 通路（KEGG Pathway）进行富集分析。

1.6 成分-靶标-信号通路网络构建

为进一步探究成分、靶标与信号通路之间的相互作用关系，利用Cytoscape3.7.0软件构建“靶标-信号通路”网络，并采用Merge功能将其与“活性成分-共同靶标蛋白互作”网络进行合并，构建白及“成分-潜在靶标互作-信号通路”网络图。

2 结果

2.1 化学成分收集与筛选

在TCMSP 和ETCM 数据库中共收集到44 种白及化学成分。根据简化后的Lipinski 五规则筛选活性成分，得到22个活性成分，结果见表1；根据OB ≥30%、DL ≥0.18 筛选出9个活性成分，结果见表2。整合二者得到的结果，去重后共计得到27个活性成分。

2.2 活性成分作用靶标筛选结果

通过Swiss Target Prediction 在线工具的分子反向对接技术和TCMSP、ETCM 数据库，共获得362个靶标，去重后为137个。

2.3 疾病靶标筛选结果

在GeneCards 数据库中检索得到20104个肺癌疾病相关基因，选取score ≥20 分的靶点，共得575个疾病基因靶标。

2.4 活性成分-作用靶标网络构建结果

利用Cytoscape3.7.0 软件中的Merge 功能取“白及活性成分-作用靶标”网络与“蛋白质相互作用（PPI）”网络的并集，获得白及活性成分与肺癌的25个共同靶标，构建“活性成分-共同靶标蛋白互作”网络，如图1所示。

表1 基于Lipinski五规则筛选的22个白及活性成分

表2 基于口服生物利用度（OB）和类药性（DL）筛选的9个白及活性成分

2.5 GO富集与KEGG通路分析

将共同靶标同时导入Metascape数据库中进行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析，得到21个富集条目，如图2所示（P＜0.01），详情见表3。

通过GO 功能富集分析，共确定了16个GO 条目。其中分子功能有2 条，分别是跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性和一氧化氮合酶调节活性；细胞成分有1条，即囊腔；涉及生物过程有13条，分别是前列腺增长、雌二醇反应、毒性反应、共生过程、肌肉细胞增殖、酸性化学反应、细胞缺氧反应、线粒体膜电位调节、横纹肌组织发育的正向调节、离子平衡、有丝分裂细胞周期相变、细胞激素代谢过程、细胞成分组织的负调控。

通过KEGG 通路富集分析，得到白及治疗肺癌可能参与的5条通路，包括表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药、PI3K-Akt信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、卵巢类固醇生成、癌症中的转录失调过程。

图1 “活性成分-共同靶标蛋白互作”网络

图2 GO、KEGG富集分析热图

表3 GO功能和KEGG通路富集结果

2.6 成分-靶点-信号通路网络构建

利用Cytoscape3.7.0 软件分别构建“成分-疾病潜在靶标互作”、“靶标-信号通路”网络，并采用其Merge功能将其与上述网络进行合并，构建白及“成分-潜在靶点互作-信号通路”网络图，按degree 值大小进行排布，如图3所示。

图3 成分-潜在靶标-信号通路网络图

由图可见，白及的25个活性成分主要通过20个潜在靶标对肺癌起治疗作用。对该网络进行拓扑结构分析，该网络共包含55个节点和248 条边，其中248条边代表成分、靶标和通路间的相互作用关系。25个绿色节点代表白及活性成分，节点平均度为2.84，大于成分节点平均度的节点有14个，包括白及菲螺醇（blespirol）、2,4,7-三甲氧基-9,10-二氢菲（2,4,7-trimethoxy-9,10-dihydrophenanthrene）、3′-氧-甲基山药素III（3′-O-Methylbatatasin III）、7-甲氧基-9,10-二氢菲-2,5-二醇（7-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-2,5-diol）、山药素III（Batatasin III）、山药素IV（Batatasin IV）、4-羟基苯甲醛（HBA 4-Hydroxybenzaldehyde）、大黄素甲醚（Physcion）等；25个飞镖形节点代表成分作用靶标，节点平均度为15.08，大于靶标节点平均度的节点有10个，分别是雌激素受体α（estrogen receptor alpha，ERα/ESR1）、前列素内环氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、ALB、热休克蛋白90α（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、v-erb-b2 红细胞白血病病毒癌基因同源物2/人类表皮生长因子受体II（verb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2/human epidermal growth factor receptor-2，ERBB2/HER2）、表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、雌激素受体β（estrogen receptor beta,ERβ/ESR2）、激酶插入区受体（kinase insert domain protein receptor，KDR）、BCL2L1、MET，其中ALB 与通路无关，故除此靶点其余皆可视为该白及治疗肺癌的关键靶点。5个橙色节点代表肺癌发生可能涉及通路，平均节点度为9.6，大于平均节点度的是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药、PI3K-Akt 信号通路，可能为白及治疗肺癌的关键通路。

3 讨论

肺癌是常见的原发性恶性肿瘤,其早期诊断率低于20%，我国80%的Ⅲ-Ⅳ期肺癌患者5年生存率仅17.7%[17-18]，预后不良。临床以化疗、放疗以及外科手术作为肺癌的主要治疗方式，其中最为有效的治疗手段当属化疗，针对癌细胞的靶向药物能较为准确地定位肿瘤，并促使癌细胞凋亡[19]，靶向药物近年来具有针对性的优势而被应用于晚期肺癌的化疗中，但存在较大的副作用，故而中药的多靶点多通路且副作用小的治疗优势愈来愈受到重视。《圣济总录》言:“肺积息贲气胀满咳嗽，涕唾脓血”[20]，肺癌咯血吐脓的特点与白及补肺、止血、消肿生肌的功效及归经相契合，具有良好的理论基础。网络药理学基于“多成分-多靶标-多通路”的理念构建“药物-靶标-疾病”多层次网络结构，达到从整体上预测药物靶标的目的[21]。本研究旨在运用网络药理学的方法，对白及中可能抑制肺癌细胞增殖、侵袭、转移的潜在成分，作用靶标以及信号通路进行分析，为进一步借助实验探究确切机制提供依据。

3.1 白及治疗肺癌的有效成分

白及的化学成分中，联苄类、二氢菲类、联菲类、联菲醚类、菲并吡喃类、三萜等为其主要成分[4,22]。其药理活性主要有抗菌、止血、抗肿瘤、抗溃疡、抗纤维化、促进伤口愈合等[23]。茋类化合物是联苄类、菲类及二苯乙烯类化合物的总称，对肺癌细胞有明显的抑制作用，而白芨药材中含量较多的主要是联苄类和菲类化合物，如白及中的关键成分Blespirol、2,4,7-trimethoxy-9,10-dihydrophenanthrene 等都属菲类化合物。仰莲[3]曾运用MTT 法初步验证了白及中的茋类化合物对非小细胞肺癌A549 细胞的增殖具有显著抑制作用，诱导A549细胞阻滞于G0/G1期。白及块茎含有粘液质多糖，其抗癌作用可能与其抑制微管蛋白的聚合有关[24]。茋类化合物通过抑制癌细胞增殖、转移和诱导癌细胞凋亡、自噬发挥治疗肺癌作用[3]。

3.2 白及治疗肺癌的潜在靶标

雌激素受体是一种核转录因子，包括雌激素受体α（estrogen receptor alpha，ERα/ESR1）和雌激素受体β（estrogen receptor beta，ERβ/ESR2）[25，26]。雌激素的表达和肿瘤的预后有着极为密切的关系，ER 具有增强肿瘤细胞恶性程度和刺激肿瘤细胞生长的作用[27-29]。ER 通过控制细胞信号转导、调控细胞周期从而影响细胞生存[30]。故抑制ERα和ERβ的表达从而抑制肺癌细胞的增殖成为可能[31]。Hamilton DH[28]发现用Fulvestrant 靶向雌激素受体信号可增强人肺癌的免疫和化疗介导的细胞毒性，雌激素信号通路通过诱导EMT影响肺癌进展。

EGFR 是上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体，其在肿瘤发生以及介导肿瘤细胞的生物学行为过程上发挥着重要的作用[32]。EGFR 与肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管的生成、肿瘤的侵袭、转移受到抑制相关。其可能机制有：EGFR 的高表达导致下游信号传导的增强；突变型EGFR 受体表达的增加引起EGFR的持续活化；自分泌环的作用增强；受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活等。EGFR 的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，其过表达主要与基因扩增、活化后降解减少有关。EGFR 的配体也极大影响了细胞内信号传导。它通过自分泌激活EGFR，从而促进癌细胞增殖，这二者的共表达往往提示肿瘤预后不良。Kopp[33]对结直肠癌的研究结果表明，在EGFR 的过表达及其配体共同表达作用下，肿瘤开始自分泌生长。另外，EGFR 可以通过调节Ang-1 和VEGF 等因子水平而影响肿瘤血管生成。李梦颖[34]发现肺腺癌胸水癌细胞EGFR 突变状态和肺腺癌增殖、侵袭、转移生物学行为有关。

PTGS2 基因又称诱导性即刻反应基因，其在正常状态下大多不表达，但在良性癌前病变和恶性肿瘤中为高表达。其表达上调，往往是受到某些炎性介质、激素、生长因子、促癌因子等刺激因素影响。前列腺素是PTGS2 高表达的主要产物，具有抑制细胞凋亡和免疫监视、促进细胞增殖和血管生成等作用[35]。

Hsp90α是机体在应激状态下合成的一组蛋白质分子，参与蛋白的合成、折叠和调控细胞内多种信号蛋白功能稳定，作为细胞内关键信号通路和细胞转录的调控者[36]。它在肿瘤细胞的凋亡和增殖、细胞周期和细胞信号转导的过程中起着调节作用，从而影响肺癌的发生和发展过程。WANG X F 等[37]的研究发现血浆中Hsp90α表达水平高低与多种恶性肿瘤的发生、发展及转移过程密切相关，细胞Hsp90α的分泌量随肿瘤恶性程度增高而升高。Hsp90α是潜在的肺癌肿瘤标志物，联合其他肺癌标志物可显著提高肺癌检出率[38]。

ERBB2是原癌基因erbB-2编码的185kDa的细胞膜受体，为表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）家族成员之一。ErbB2 高表达时，肿瘤细胞增殖能力增强，其分化成熟和凋亡机制受到抑制，Ras-MAPK 和PI3K-Akt 信号传导活性增强，从而增强细胞恶性程度。周转转等发现[39]非小细胞肺癌中ErbB2 阳性表达率较癌旁组织明显升高，可作为肿瘤免疫生物治疗的理想靶点。

KDR 能与VEGF 结合并发挥信号传递的作用[40]，其表达水平影响着血管新生过程，高表达的KDR基因促使肿瘤细胞新生血管，从而提高了肿瘤细胞的复发率和转移率[41]。娄晓宇等发现[42]VEGF 和KDR 参与了肺癌的发生、发展和转移过程，其可作为肺癌恶化的一项生物学指标。

c-MET 是肝细胞生长因子的受体酪氨酸激酶,被证实为NSCLC 患者的不良预后因素[43]，c-MET 过表达与NSCLC 预后差有关。c-MET 阳性往往可引起局部复发，而脉管受侵也可引起远处转移。脉管受侵是NSCLC 患者远处转移的危险因素，由于血管、淋巴管是肿瘤细胞的存储库，故成为了肿瘤细胞转移、扩散的常见途径。c-MET 与癌症的发生发展关系密切，主要与肿瘤细胞的增殖、迁移、浸润、凋亡及血管生成过程有关[44]。

3.3 关键通路分析

3.3.1 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抗性

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibition，EGFRTKI）在NSCLC 中的疗效值得肯定。识别突变和抑制其活性的药物已成为晚期肺癌的主要治疗手段,但不幸的是，这些药物疗效受到普遍耐药性发展的限制。AXL 属于受体酪氨酸激酶家族，在多种肿瘤细胞中过表达，是多种肿瘤常规化疗和药物靶向耐药治疗过程的重要分子标记[45]。AXL 激酶是NSCLC 活化后的受体酪氨酸激酶之一，其过表达是携带EGFR 敏感突变因子的肺癌患者对EGFR-TK1 产生耐药的重要机制之一。研究酪氨酸激酶抑制剂耐药的生物化学机制可能为提高靶向治疗的疗效提供新的治疗靶点。

3.3.2 PI3K-Akt信号转导途径

PI3K 参与多种细胞因子转导途径，阻断此途径可降低肺癌细胞中SKP-2 蛋白表达水平，将细胞周期阻滞于G1/S 期复合体。Akt 是PI3K 的下游分子，也是PI3K/AKT 信号通路的关键，活化后的AKT 通过磷酸化反应激活下游靶蛋白，从而控制转录、翻译、凋亡和细胞周期等生物学效应。。PI3K/Akt 信号通路在超氧化物和雌激素抵抗肿瘤坏死因子等因素诱导凋亡的过程中具有重要意义，如雌激素可通过Ras/PI3K/Akt信号通路诱导凋亡相关蛋白BAD的磷酸化过程。

综上所述，白及的活性成分通过多靶标作用于多条信号通路上，通过抑制癌细胞增殖、转移和诱导癌细胞凋亡、自噬等过程发挥治疗肺癌的作用。在临床实际应用中，白及虽然常被运用于中医肺癌治疗中，但往往仅作为随证加减辅助用药，多为了缓解肺部咯血症状或者用于消肿生肌，其治疗肺癌的能力还有待不断挖掘验证。目前针对白及治疗肺癌的相关基础研究较少，大多数研究关注点在于白及治疗肿瘤的活性成分，且对其发挥抑癌作用的机理尚不明确。随着白及在抗肿瘤领域研究的深入与发展，不仅要明确白及化学成分及药理作用,还要进一步阐明白及的药效物质基础及作用机制。本文首次基于网络药理学方法，挖掘出白及发挥治疗肺癌作用的潜在靶标及相关通路，并建立起“药物成分-靶标-信号通路”之间发挥药效作用的关系网络。立足于现有预测靶点及其相关通路，结合细胞水平、动物水平等实验，验证白及的抗肺癌活性，为白及的药理作用、新药研发、质量控制等提供科学依据。