ZNF692基因在肾透明细胞癌中的表达及其与患者预后间关系的研究

徐兆平，王浩飞

（上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科，上海 200025）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一种常见的化疗耐药性的恶性肿瘤。肾细胞癌占所有恶性肿瘤的3%，全球范围内每年因肾癌死亡的患者约有14万例，而新确诊的患者约有35万例[1]。在过去的20年中，肾癌在全球范围内的发病率增加了2%左右[2]。在我国，肾癌的发病率也呈现逐年升高的趋势，每年新发肾癌病例数约为6.83万例，发病率约为4.99/10万[3]。肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是肾癌中的主要亚型，约占85%。目前，ccRCC患者的5年的总体生存率约为76%，TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者预后较好（约为90%），TNM分期为Ⅲ期患者的5年总体生存率则降至55%左右，而发生肿瘤转移患者的5年总体生存率不足10%[4]。因此，亟需有效的ccRCC相关预后分子标志物，以帮助早期判断ccRCC的临床疗效，为早期干预提供依据。

ZNF692是一个含锌指结构的转录因子，被报道参与了多种肿瘤的发生、发展，并与多种肿瘤的预后不良相关[5-7]，如在结肠直肠癌[5]、肺癌[6]和肾细胞癌[7]中ZNF692的高表达与这些肿瘤的预后不良相关，但其在ccRCC中的作用及预后价值尚未可知。基于此，本研究拟通过生物信息数据挖掘分析ccRCC样本及分析本院收治的ccRCC患者肿瘤样本中ZNF692的表达水平，并探讨ZNF692在ccRCC中的临床预后价值。

资料与方法

一、资料

1.数据库测序资料收集：收集1998年至2020年癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中测序数据完整（包括TNM分期信息及生存时间信息等）、临床信息齐全的531例ccRCC患者（包括Ⅰ期267例、Ⅱ期57例、Ⅲ期123例及Ⅳ期84例）肿瘤组织的转录组测序（RNA-seq）数据，其中516例临床预后信息完整[8]。

2.临床样本收集：随机收集2019年9月至10月上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科20例ccRCC术后病理确诊的组织样本和相应的配对癌旁组织标本。所有患者均签署了知情同意书。

二、方法

1.生物信息数据挖掘：对TCGA数据库中ccRCC的RNA-seq数据进行分析，明确516例患者中ZNF692基因的表达水平，以及分析这些患者的临床信息（包括生存时间、临床分期等）。分析对照组及ccRCC患者ZNF692基因的表达水平；根据ZNF692表达水平将患者分为ZNF692高表达组和ZNF692低表达组。

组蛋白修饰对于基因的表达调控具有重要作用，而H3K27ac组蛋白修饰被认为是基因转录激活及高表达的重要标志之一，故本研究收集美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）收录的肾癌细胞中H3K27ac CHIP-seq数据[9]，并对其进行生物信息学分析，使用Bowtie2软件对高通量测序数据进行比对[10]，然后使用Homer分析软件生成BedGraph文件[11]，最后通过UCSC基因组浏览器（UCSC genome browser）展示ZNF692转录调控区域中H3K27ac修饰情况，以明确ZNF692在肾癌中高表达或低表达的原因。

2.ccRCC及癌旁组织的RNA提取及ZNF692表达定量：将ccRCC患者的新鲜手术样本分为肿瘤组织和癌旁组织，然后加入1 mL Trizol（Invitrogen公司），置于-80 ℃下保存。提取RNA时，先将Trizol复温至室温，然后加入0.2 mL氯仿，重复混匀后静置10 min；行12 000 r/min离心10 min，取400 μL上清液，加入400 μL异丙醇，再行12 000 r/min离心10 min；弃去上清液后加入1 mL 75%乙醇洗涤，行12 000 r/min离心10 min；弃去上清液，待干燥后，加入50 μL焦碳酸二乙酯水溶解。采用诺唯赞公司的一步法定量反转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）定量试剂盒，进行定量检测。ZNF692的检测引物序列如下。ZNF692上游引物为5′-TTCCGCACTAGCAGCAACC-3′；ZNF692下游引物为5′-AAACCCGCATATCTCACACTG-3′。

3.ZNF692基因敲低在体外细胞株增殖中的作用

（1）细胞体外培养：ccRCC的786-O与769-P细胞系由中国科学院细胞库提供。将细胞培养于37 ℃5% 二氧化碳培养箱中，所用培养基为添加了10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibico公司）的DMEM（Gibico公司）培养基。

（2）小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染：转染细胞共有3组，分别为阴性探针组、敲低ZNF692组1（即siZNF692-1）和敲低ZNF692组2（即siZNF692-2）。针对ZNF692基因的siRNA订购于广州锐博生物科技有限公司，探针序列如下。siZNF692-1正义链为5′-GGAAGAGGGUGAGGAAGAAdTdT-3’；siZNF692-1反义链为5′-UUCUUCCUCACCCUCUUCCdTdT-3′；siZNF692-2正义链为5′-GGAAGAAGAGGACAAUGAUdTdT-3′；siZNF692-2反义链为5′-AUCAUUGUCCUCUUCUUCCdTdT-3′。使用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000进行siRNA转染。

（3）CCK8检测：使用日本同仁化学公司的细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK8）检测试剂盒对靶向ZNF692基因的siRNA或阴性对照siRNA转染后的细胞进行细胞活力检测。检测仪器为Thermo公司的酶标仪，检测波长为450 nm。

4.统计学处理：统计分析均使用GraphPad-Prism 8.0软件完成。使用Logrank检验方法分析ZNF692表达水平与临床预后的关联。使用非配对t检验方法分析数据库中正常组织及不同分期肾透明细胞癌组织中ZNF692表达水平的差异。使用配对t检验方法分析肾透明细胞癌组织与配对正常组织中ZNF692的表达差异。使用Pearson相关性分析方法以及Spearson相关性分析方法检验ZNF692表达水平与DNA拷贝数、DNA甲基化之间的相关性。使用非配对t检验分析敲低ZNF692后细胞增殖能力的差异。

结果

一、ZNF692基因在ccRCC组织中高表达

图1 ZNF692基因在ccRCC组织中高表达

收集TCGA数据库中的ccRCC RNA-seq数据提示，获得对照组（n=72）及TNM分期为Ⅰ期（n=267）、Ⅱ期（n=57）、Ⅲ期（n=123）、Ⅳ期（n=84）的患者中ZNF692的表达情况。结果发现，与对照组比较，ZNF692在ccRCC组中的表达显著增加（Mann-Whitney U检验，P<0.000 1）（见图1A）。随着TNM分期的增加，ZNF692的表达也增加，Ⅰ期比Ⅱ期（Mann-Whitney U检验，P=0.04）、Ⅰ期比Ⅲ期（Mann-Whitney U检验，P=0.002）、Ⅰ期比Ⅳ期（Mann-Whitney U检验，P=0.006）差异均有统计学意义（见图1B）。

进一步对本院收集的20对配对样本进行qRT-PCR检测，分析ZNF692的表达水平。临床样本检测也发现，ZNF692基因在肿瘤样本中高表达（配对t检验，P<0.001）。结果证实，ZNF692基因在ccRCC组织中高表达。

二、ZNF692高表达与ccRCC预后不良相关

根据RNA-seq数据中ZNF692的mRNA表达水平，将ccRCC患者分为ZNF692高表达组（n=258）与ZNF692低表达组（n=258），并分析ZNF692高表达与低表达ccRCC患者的总生存期以及无事件生存时间。结果发现，ZNF692高表达组患者的总生存期（Logrank统计分析，P<0.001）（见图2A）以及无事件生存期（Logrank统计分析，P<0.001）（见图2B）显著低于低表达组，提示ZNF692表达量有重要的临床预后价值。

图2 ZNF692高表达与ccRCC预后不良相关

三、ZNF692的高表达与c-MYC癌基因转录激活相关

为明确ZNF692在ccRCC中高表达的机制，本研究首先在基因组水平分析了ZNF692表达水平与DNA拷贝数以及DNA甲基化间的关系。

利用TCGA数据库中的DNA拷贝数分析数据、DNA甲基化数据及转录组测序数据，本研究分析了ZNF692的DNA拷贝数、DNA甲基化以及mRNA表达水平。与以往的认知一致，结果发现ZNF692在ccRCC肿瘤样本中的表达水平与DNA拷贝数呈正相关（见图3A），而与DNA甲基化水平呈负相关（见图3B），说明基因组水平的DNA拷贝数变异增加可以提高ZNF692的表达水平，而调控区域CpG岛上的甲基化增加则会降低ZNF692的表达水平。整体来看，ZNF692基因的DNA甲基化水平维持在一个很低的水平，这也为肿瘤样本中整体ZNF692高表达了提供了表观及转录调控的基础。

组蛋白H3赖氨酸27位点乙酰化（H3K27ac）富集修饰与基因的高度活化及高表达存在密切关联，H3K27ac高乙酰化状态往往引起基因的高表达。本研究分析了8例ccRCC组织中ZNF692基因的H3K27ac状态。结果发现，在ZNF692转录调控区域存在H3K27ac的富集（见图3C），提示ZNF692转录调控区域为高度活化状态。

四、敲低ZNF692抑制ccRCC细胞增殖

本研究随后对ZNF692在ccRCC中的功能进行进一步探索。使用靶向ZNF692的siRNA处理ccRCC细胞系786-O和769-P，可成功抑制ZNF692的表达水平（见图4A）。siRNA处理2 d和3 d后，可显著抑制786-O和769-P细胞的增殖（见图4B），提示ZNF692基因可作为ccRCC的潜在治疗靶点。

图3 ZNF692在ccRCC中异常高表达的机制探索

讨论

图4 敲低ZNF692显著抑制ccRCC细胞系增殖

ZNF692是一个含有锌指结构的蛋白编码基因，主要作为转录因子在细胞核中发挥转录调控功能。最早的研究报道显示，ZNF692在糖异生中起重要作用，转录因子ZNF692被腺苷一磷酸激活的蛋白激酶在Ser470位点磷酸化，然后抑制糖异生的关键酶——磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶的表达[12-13]。近年来，肿瘤相关研究中发现，ZNF692在肿瘤的发生、发展中发挥重要的调控功能。Huang等[7]进行了基因表达分析，并报道ZNF692与肾母细胞瘤的复发有关。Zhang等[6]的研究证明，ZNF692在肺癌组织中的表达升高，而ZNF692的下调抑制了肺癌细胞在体外的增殖、迁移和侵袭，并通过动物模型证实了ZNF692敲低可抑制肺癌细胞在体内的致瘤性。Xing等[5]发现，所有结肠直肠癌组织和细胞系均显示出ZNF692高表达，且ZNF692的高表达与结肠直肠癌患者的淋巴结转移、远处转移及肿瘤分期显著相关。然而，目前尚不清楚ZNF692在ccRCC中的致癌作用及其在肿瘤进展中的功能。

本研究中发现，ZNF692基因在ccRCC组织中异常高表达，且与ccRCC患者的预后不良密切相关。DNA拷贝数异常与基因的表达及肿瘤的发生间存在密切联系，正常细胞中DNA拷贝数为2个拷贝（即2条染色体），但在肿瘤中某些肿瘤相关位点往往存在拷贝数变异，这些变异可引起癌基因或抑癌基因表达异常。DNA甲基化是基因表达调控的另外一种方式，DNA甲基化可调控染色质结构、DNA构象，并影响DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式，从而控制基因表达。启动子区域的DNA低甲基化是基因高表达的前提之一。此外，大量研究表明基因的RNA表达水平大部分取决于其转录活性，而特定的组蛋白修饰是反映其转录活性的重要标志。进一步分析上游调控机制，本研究发现在ccRCC患者的肿瘤组织中存在DNA拷贝数增加、DNA甲基化降低以及H3K27ac修饰高度富集的状态，这些与基因表达增加的特征可能是导致ZNF692在ccRCC组织中高表达的原因。此外，本研究还在ccRCC细胞系769-P和786-O中敲低了ZNF692的表达水平，并观察到这2个细胞的增殖受到显著抑制，提示ZNF692对于维持ccRCC细胞高增殖状态具有重要作用。

本研究发现，ZNF692的表达情况与ccRCC患者的预后密切相关，是有非常有价值的预后分子标志物，检测ZNF692的表达水平可用于预测ccRCC的复发、转移并进行早期干预。后续仍需进一步深入研究其下游的机制，将并揭示其致病机制。