儿童伯基特淋巴瘤中差异表达基因的鉴定及临床应用

孟磊俊，张 晶，王雪莉，李 治，张 泓，曾乃燕

（1.上海交通大学医学院病理生理学系，上海 200025；2.上海市儿童医院a.检验科，b.病理科，上海 200040）

非霍奇金淋巴瘤是儿科肿瘤中居第4位的常见恶性肿瘤，而其中伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma,BL）占儿童非霍奇金淋巴瘤的50%～60%[1]。BL是一种侵袭性疾病，起源于滤泡生发中心细胞，具有肿瘤细胞倍增时间短、侵袭性强等特点。据文献报道，BL可能具有独特的发病机制，与其他B细胞淋巴瘤不同，其形成可能并不依赖核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号通路[2-3]，而8号染色体上c-MYC基因易位是其特征标志之一[4]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide3-kinase,PI3K）信号通路与MYC基因的协同作用可能是导致BL发生的关键[5-6]。此外，内源性RAS/RAF信号通路在MYC基因诱导的淋巴瘤形成和促进B细胞存活中也可能发挥了重要作用[7]。因此，全面、准确地鉴定这些信号通路中相关基因的变异和表达情况，可能可以为儿童BL的诊治提供合适的临床分子靶标和方法。

近30年来，随着高剂量、短疗程的利妥昔单抗联合多药化疗方案和系统的鞘内注射被广泛应用，BL患儿的生存率有了很大提高，5年无事件生存率超过80%[8-9]。然而高强度的化疗方案也会导致明显的急性毒副反应，且有部分复发和（或）难治性BL患儿对化疗有很强的耐药性，且很难治愈。因此，研发针对儿童BL的毒副反应小的靶向药物，以及建立准确的诊断和预后评估方法，都是临床改善儿童BL治疗效果和提高治愈率的关键。

本研究对2015年至2018年间接受淋巴瘤切除术的BL患儿石蜡组织切片中的MYC与PI3K信号通路协同作用相关基因以及NF-κB和RAS/RAF信号通路相关基因的表达情况进行全面研究，从mRNA和蛋白水平比较分析这些基因在儿童BL肿瘤组织与非肿瘤患儿的正常淋巴结组织中的表达，鉴定可用于儿童BL临床诊断的特异性分子靶点，并探讨其与儿童BL发生、发展间的相关性，以期为BL的分子机制研究及诊断、治疗、预后判断提供新的方法和依据。

资料与方法

一、资料

收集2015年9月至2018年5月在上海市儿童医院接受淋巴瘤切除术的18例BL患儿的淋巴瘤组织，患儿的年龄在2～11岁，中位年龄为5.5岁，男女比例为5∶1。所有病例均进行了病理学复查，包括分析组织细胞形态和免疫组织化学（免疫组化）（CD10或BCL6、BCL2和Ki-67）的结果，并根据最新的2016版世界卫生组织淋巴瘤分类要求进行诊断鉴定[10]。另收集20例非肿瘤患儿的正常淋巴结组织作为对照，患儿的年龄为2～12岁，中位年龄为4岁，男女比例为7∶3。2组患儿间的年龄、性别比例差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究在上海市儿童医院伦理委员会批准下，按照伦理要求对样本进行研究。

二、方法

1.样本处理：收集18例儿童BL淋巴瘤组织标本和20例儿童正常淋巴结组织样本，经4%甲醛溶液浸泡后进行石蜡包埋。

2.实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测标本中相关基因表达：采用实时荧光定量PCR方法对BL组织及正常淋巴结组织中共27个候选基因的mRNA水平表达进行相对定量分析，包括MYC靶点与PI3K信号通路协同作用相关基因TCF3、ID3、CDK6等，NF-κB信号通路相关基因CD44、C-FLIP、BCL2、CCND2等，以及RAS/RAF1信号通路相关基因KRAS、NRAS、RAF1等。

（1）核酸提取：从每个样本蜡块上切取10 μm切片，取2～3片，用常规二甲苯脱蜡和梯度酒精水化后，分别置于1.5 mL离心管中，使用RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）提取RNA。用NanoDrop2000超微量紫外分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）测定核酸质量和纯度后，置于-80 ℃下冻存备用。

（2）实时荧光定量反转录PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）：用DNA-free Kit DNase Treatment and Removal Reagents（Thermo Fisher Scientific，美国）处理RNA中残留的DNA，用SuperScriptⓇⅢFirst-Strand Synthesis Super Mix（Thermo Fisher Scientific，美国）进行cDNA合成，用2×SsoFastTMEvagreenⓇSupermix with Low Rox（BioRad，美国）检测基因的表达水平。基因特异性引物序列（见表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

以18S rRNA作为内参基因，用ABI QuantStudio Dx实时荧光定量PCR仪（Thermo Fisher Scientific，美国）仪进行检测，反应条件为95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共45个循环；熔解曲线95 ℃10 s，65 ℃60 s，97 ℃1 s。

所有样品均进行复孔检测，取循环阈值（cycle threshold，Ct）的平均值，确认靶基因和内参基因的cDNA扩增效率是相同的，用目的基因与内参基因的比值（ΔCt）来计算每个靶基因的相对表达量。

3.免疫组化分析：对于儿童BL组织中在mRNA水平上有明显变化的目的基因，采用免疫组化技术，从蛋白水平上进行分析，比较18例BL组织与随机选取的5例正常淋巴结组织中以上基因的蛋白水平表达差异。切取4 μm厚的组织白片进行脱蜡和水化、抗原修复、抗体孵育及显色[11]。免疫组化分析的目标蛋白和抗体见表2。由2位对患者治疗和预后不知情的病理医师，分别对切片的免疫染色结果进行评估。在显微镜下根据细胞染色强度评估蛋白的表达水平，结果计为无表达（-）、弱阳性（+）、阳性（++）和强阳性（+++）。用KF-PRO-005数字扫描仪（宁波江丰生物信息技术公司），在40倍镜下进行全片扫描，获得数字图像并保存。

表2 免疫组化抗体

4.荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测c-MYC基因：BL所用探针为c-MYC（8q24）基因断裂探针（广州安必平医药科技有限公司），实验室操作参照说明书。使用Leica DM6000B荧光显微镜观察结果，用CytoVision软件采集图像。在1个细胞核中，当2对绿色和红色荧光信号均发生融合时，提示c-MYC基因未发生断裂；当至少有1对绿色和红色荧光信号未发生融合时，则提示c-MYC基因发生断裂。计数至少100个肿瘤细胞，当发生c-MYC基因断裂的肿瘤细胞大于10%时，则判定为阳性。

5.统计学处理：用SAS 9.4软件进行数据分析。采用t检验对目的基因在肿瘤组织与正常组织中的表达进行比较，采用Fisher's精确检验进行临床特征及指标的相关性分析。当P<0.05时认为差异有统计学意义。

结果

一、临床分析

18例BL患儿中，临床分期为Ⅱ期者为3例，Ⅲ期为13例，Ⅳ期为2例。18例BL患儿均无侵犯中枢神经系统的临床表现，但有2例累及骨髓；发病部位主要为腹腔（9例），其次为鼻咽部（3例）。18例BL患儿均进行了c-MYC基因易位的FISH检测，其中13例发生断裂，5例正常。18例BL患儿中有1例未完成化疗，1例发生肿瘤溶解综合征（见表3）。

二、儿童BL相关基因的mRNA水平表达情况

采用实时荧光定量RT-PCR技术检测BL组织与正常淋巴结组织中27个相关基因的mRNA水平表达差异，结果显示MYC基因在BL组织中显著高表达（P<0.05）。

1.MYC基因与PI3K信号通路协同作用相关基因的表达情况：与正常淋巴结组织相比，BL组织内MYC基因与PI3K信号通路协同作用的目的基因中CDK4、ID3、TCF3、CCND3、CDK6呈现出了类似的高水平表达（P<0.05），差异有统计学意义；而PTPN6的表达则受到抑制，差异有统计学意义（P<0.05）。但2组间比较，在实体瘤发生、发展中经常起抑制作用的基因TP53、PTEN、CDKN2A的表达差异无统计学意义（P>0.05）（见表4）。

2.NF-κB信号通路相关基因的表达情况：与正常淋巴结组织相比，BL组织中NF-κB信号通路的目的基因BCL2、CD44、C-FLIP、CCND2、A20的表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而2组间IRF4、CD69、CCR2A、IκB-ɑ、TLR6及 ABIN家族基因（ABIN1、ABIN2、ABIN3）的表达差异无统计学意义（P>0.05）（见表5）。

表3 18例儿童BL的临床特征

表4 儿童BL组织与正常淋巴结组织中MYC基因与PI3K信号通路协同作用相关基因mRNA的表达

3.RAS/RAF信号通路相关基因的表达情况：在RAS/RAF信号转导通路中，NRAS和RAF1在BL组织中显著高表达，与正常淋巴结组织比较，差异有统计学意义（P<0.05）。而RAS家族的另一个成员KRAS，其在2组间的差异无统计学意义（P>0.05）（见表6）。

三、儿童BL相关基因蛋白水平的表达

对于上述儿童BL组织中mRNA表达水平上有明显变化的目的基因，包括MYC、ID3、TCF3、CCND3、CDK4、CDK6、PTPN6、NRAS、RAF1、A20、BCL2、CD44、C-FLIP、CCND2共计14个，进行免疫组化分析。结果显示，MYC、ID3、TCF3、CCND3、CDK4、CDK6、PTPN6、NRAS、RAF1、A20、BCL2、CD44的蛋白水平与其mRNA水平的表达一致。其中MYC、ID3、CCND3、CDK4、CDK6、NRAS在T中的表达升高，而PTPN6、CD44、C-FLIP在BL组织中的表达下降。BL组织与正常淋巴结组织中的CCND2蛋白水平表达量差异则无明显变化（见图1～4）。

表5 儿童BL组织与正常淋巴结组织中NF-κB信号通路相关基因mRNA的表达

四、儿童BL的分子靶标与临床数据间的相关性

对儿童BL的相关基因表达分子指标与其临床特征指标进行相关性分析，结果显示，c-MYC基因易位或BCL2蛋白水平表达与BL患儿的性别、临床分期、预后、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平及尿酸（uric acid，UA）水平间均无相关性（P>0.05）。

表6 儿童BL组织与正常淋巴结组织中RAS/RAF1信号通路相关基因mRNA水平的表达

然而，本研究在预后不良的4例BL患儿中都检出了c-MYC基因易位，而预后较好的13例BL患儿中有4例没有c-MYC基因易位。将c-MYC基因易位与BCL2等相关基因的蛋白表达结果相结合进行分析，发现存在c-MYC基因易位同时伴有BCL2表达（BCL2+）与高LDH水平、LDH和UA联检呈高水平这2个临床指标之间具有显著相关性（P<0.05）（见表7）；而c-MYC基因易位联合其他蛋白表达与上述临床特征及指标间均无关系（P>0.05）。进一步分析带有c-MYC基因易位但BCL2表达不同的13例BL患儿，其中6例有BCL2表达（BCL2+），7例BCL2无表达（BCL2-），结果发现同时具有c-MYC基因易位伴BCL2+的BL患儿，其血清LDH水平高于正常（P<0.05），但与其他临床特征间无相关性（P>0.05）（见表8）。

图1 MYC、ID3、TCF3、CCND3蛋白在儿童BL组织与正常淋巴结组织中的表达情况

图2 CDK4、CDK6、PTPN6、A20蛋白在儿童BL组织与正常淋巴结组织中的表达

图3 BCL2、CCND2、CD44、C-FLIP蛋白在儿童BL组织与正常淋巴结组织中的表达

图4 RAF1、NRAS蛋白在儿童BL组织与正常淋巴结组织中的表达情况

讨论

BL是一种高度侵袭性淋巴瘤，是儿童和青少年侵袭性淋巴瘤中较为常见的非霍奇金淋巴瘤之一。尽管目前的多药联合化疗方案可使BL患者的5年无事件生存率达到80%以上[8-9]，然而对于部分复发和（或）难治性儿童BL的治疗效果仍不甚理想。本研究通过实时荧光定量RT-PCR技术及免疫组化技术，分析MYC与PI3K协同调控相关基因以及NF-κB和RAS/RAF信号通路相关基因在儿童BL组织与儿童正常淋巴结组织中的mRNA和蛋白水平表达情况，并进一步探讨其与临床表现之间的关系。

一、临床资料特点

本研究的儿童BL病例中，男女比例为5∶1，显示本组儿童BL多发于男性。儿童BL常出现在腹部脏器，包括回盲部、卵巢等[4]，本研究中发病部位在腹部为9例，其中主要为回盲部，与文献报道一致。本研究的18例儿童BL病例中，Ⅲ～Ⅳ期者为15例，其中2例累及骨髓，比例均低于国内外文献报道[9,12]，但仍以晚期患儿居多。

二、各通路基因

本研究显示，MYC基因作为BL的分子标志在BL中高表达，与之前Lee等[12]用DNA微阵列技术分析BL分子表达谱后发现MYC基因在BL中呈高表达水平的描述一致。MYC致癌基因对细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤发生、转移等过程起关键性的调控作用。

1.PI3K：MYC基因信号转导可激活CCND2以及CDK4，并下调细胞周期抑制剂，最终诱导细胞增殖和生长[13]。然而，本研究显示，在mRNA水平上CCND2表达在BL中被抑制，而CDK4则在BL中高表达，提示CDK4可不依赖于CCND2而直接通过MYC驱动来促进BL细胞增殖、生长。

ID3是MYC的直接转录靶点。本研究结果显示，ID3在BL组织中高表达，与之前的研究结果一致[2]。在正常B细胞中，ID3可通过负调控TCF3发挥抑制肿瘤的作用，从而抑制细胞循环发展和细胞增殖[14]。TCF3功能获得性突变和ID3功能缺失性突变是BL的特征之一[6,15-16]，这些突变打破了ID3负反馈环，使TCF3表达上调，从而增强BCR信号，并激活PI3K信号转导通路，维持细胞存活[6]。在本研究的儿童BL病例中，TCF3呈现高表达，提示其不受高表达的ID3所抑制。这可能由于ID3在这些病例中并不是功能健全的蛋白，或TCF3存在功能获得性突变，使其不受ID3负调控，需要从基因层面进行ID3和TCF3的突变分析以及蛋白的功能分析来进一步证实。

Lee等[12]在BL分子表达谱分析中发现PTPN6呈高表达，而本研究则发现PTPN6在BL中被抑制。有研究认为，TCF3可通过抑制PTPN6转录，下调BCR信号转导的负调节因子磷酸酶SHP-1以增强BCR信号，从而激活PI3K信号转导通路[17]，这与本研究发现PTPN6在BL中被抑制的结果相符合。此外，有研究报道TCF3还可直接反式激活CCND3，促进细胞增殖[6]。CDK6受CCND3调节，两者相互作用调节细胞周期的G1期和G1/S期的转变[6]。本研究的18例BL患儿中CCND3和CDK6均呈高表达，表明TCF3高表达可上调CCND3和CDK6表达。CDK家族异常活化可使细胞周期失调，导致肿瘤细胞异常增殖及DNA突变、染色体畸变、染色体数目变异等[18]。因此，CCND3和CDK6表达增加有助于BL细胞增殖，并可能导致细胞恶性发展。此外，本研究的儿童BL病例中CDK4的蛋白表达强度多为-或+，相较于正常淋巴结组织表达强度-，升高并不多；而CDK6在儿童BL病例中表达强度为++～+++，远高于正常淋巴结组织的表达强度+，提示儿童BL细胞增殖可能更依赖于CCND3和CDK6，而非CDK4。

2.NF-κB信号转导通路：本研究结果显示，NFκB信号通路目的基因A20、BCL2、CD44、C-FLIP、CCND2在BL组织中多被抑制，或与正常淋巴结组织中的表达相当（如IRF4、CD69、CCR2A、IκB-ɑ、TLR6等），提示NF-κB信号通路在儿童BL中的活性可能并不高。Dave等[2]研究发现，BL的形成可能并不依赖于NF-κB信号通路，与本研究结果一致。

3.RAS/RAF信号转导通路：RAS/RAF信号转导通路对细胞生长、分化及细胞存活至关重要，其可调节下游靶基因MYC mRNA表达并促进其稳定[7]。Lee等[12]在BL的MAPK信号通路研究中发现RAF1高表达，而在本研究的BL患儿中RAF1也呈现了同样的高表达趋势。此外，本研究还发现NRAS在BL中显著高表达，而BL与正常淋巴结组织中KRAS表达则无差异，提示在RAS家族中NRAS可能是BL的重要靶点，RAS/MAPK信号通路可通过NRAS/RAF1途径使MYC磷酸化，促进BL细胞增殖和抗凋亡。

三、本研究结果中基因靶点及预测意义

近年来，已有几项药物临床试验使用BL靶向基因抑制剂，如抑制MYC表达的NCT01897012，针对MYC基因易位的NCT02700022、NCT02481310和NCT01897012等。本研究结果支持了针对儿童BL的靶向PI3K激酶途径、MYC信号转导、TCF3信号转导、CCND3/CDK6途径以及NRAS/RAF途径的药物开发（见图5），为这些信号通路抑制剂在BL治疗中的研发的应用提供了新的线索和证据。

“双打击”是弥漫大B细胞淋巴瘤的特征，主要为MYC基因和BCL2基因易位[19]，而在BL病例中BCL2基因易位的发生率很低，仅为3.5%[20]。但有研究报道，33%的BL病例表达BCL2蛋白[20]。本研究中亦有9例BL患儿存在BCL2蛋白表达，高于之前的文献报道。Strasser等[21]使用Em-Myc模型进行研究，证明MYC和BCL2可在功能上合作以加速淋巴瘤的发展。因此，本研究进一步分析了c-MYC基因易位及BCL2蛋白水平表达与临床特征及指标间的关系，结果显示，当c-MYC基因易位与BCL2表达分别作为独立因素时，与临床特征及指标均无相关性。c-MYC基因易位是BL的特征标志，本研究BL患儿的FISH检测结果中，c-MYC基因易位占72.2%（13/18），低于杨文萍等[22]在BL分子遗传特征研究中报道的93.1%。尽管本研究显示，c-MYC基因易位与临床特征及指标间无相关性，但本研究在4例预后不良的儿童BL病例中均检测出了c-MYC基因易位（阳性为4/4），而预后较好的13例病例中有4例无c-MYC基因易位，提示c-MYC基因易位可能与儿童BL的预后有关，而由于本研究纳入的病例数较少，可能无法获取统计学相关性。

本研究发现，c-MYC基因易位伴BCL2+与血清LDH升高显著相关。LDH在肿瘤分期、肿瘤负荷、治疗和预后判断等临床表现中均具有重要指示意义。本研究结果表明，c-MYC基因易位伴BCL2+可能与BL患儿较晚的肿瘤分期、较大的肿瘤负荷以及不良的预后等临床表现密切相关。有研究报道，在BL中，UA升高与肿瘤溶解综合征有关[23]。本研究结果显示，c-MYC基因易位伴BCL2+虽与UA升高间无统计学相关性，但与LDH和UA同时升高有关，在发生LDH、UA同时升高的4例儿童BL病例中有1例发生了肿瘤溶解综合征，提示当儿童BL的病理诊断结果出现c-MYC基因易位伴BCL2+时，在临床治疗中需要预防肿瘤溶解综合征的发生。

总之，本研究通过对上述信号通路的相关基因在mRNA和蛋白水平上表达情况的分析，发现MYC、TCF3、CCND3、CDK6、NRAS和RAF1等基因可能是儿童BL的重要治疗靶点，而检出c-MYC基因易位伴BCL2+对BL的临床肿瘤分期、肿瘤负荷以及治疗和预后判断具有辅助诊断作用。由于本研究的样本数量有限，以上研究结果还需通过更多临床病例样本进行检测分析，并进一步对结果进行验证和修订。