Beclin-1和Bcl-2表达与非小细胞肺癌患者病理特征及预后间关系的研究

杜海磊 ，陈 聆，罗方秀，李 勇，程齐俭，朱良纲，杭钧彪

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院胸外科，上海 200025；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院北院a.呼吸科，b.病理科，上海 201801）

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率高居恶性肿瘤的第一位[1]，故寻找新的治疗靶点对于肺癌患者的治疗和预后具有深远的意义。细胞凋亡和自噬作为Ⅰ型和Ⅱ型程序性细胞死亡机制，调控肿瘤细胞的增殖及死亡，与肿瘤的发生、发展密切相关[2-4]。Bcl-2蛋白家族与Beclin-1蛋白间相互作用，在肿瘤细胞的程序性死亡中发挥重要的调节作用。近年来，Beclin-1或Bcl-2蛋白的异常表达已在多种肿瘤中被证实，然而关于两者在癌症中的关系及相应的机制仍未被完全阐明。本研究拟检测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织中Beclin-1和Bcl-2蛋白的表达量,探讨Beclin-1和Bcl-2蛋白在NSCLC中的表达情况及其临床意义。

资料与方法

一、资料

2014年1月至2014年12月期间，选择在我院胸外科住院行外科手术切除并经病理学检查确诊的120例NSCLC患者。所有患者术前均未行新辅助化疗。120例患者中，男性56例，女性64例，年龄为45～75岁，中位年龄为61.5岁。将患者按2009年国际抗癌联盟（International Union Against Cancer,UICC）第7版TNM分期，分为Ⅰ期（59例）、Ⅱ期（42例）、Ⅲ期（19例）。本研究对所有患者进行随访，随访时间截止至2019年11月。

二、方法

1.Belicn-1及Bcl-2蛋白表达检测：采用免疫组织化学（免疫组化）法检测Belicn-1及Bcl-2蛋白的表达情况。将抗Beclin-1及抗Bcl-2鼠单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）按1∶100稀释。由5位不同的病理科医师对免疫组化染色的组织切片进行阅片，采用双盲阅片评分。随机挑选5个高倍视野（×400），每个视野计数100个细胞，随后进行评分。对有争议的结果进行协商后得出评分（评分A）。评分标准如下。阳性细胞≤10%计1分；阳性细胞百分率在11%～50%计2分；阳性细胞百分率在51%～75%计3分；阳性细胞百分率＞75%计4分。在低倍镜（×100）下观察染色强度（评分B），染色评分标准如下。0分为不染色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。最后评分为A×B，并按评分≤3分为低表达，而评分>3分为高表达进行统计[5]。

结果

一、NSCLC组织中Beclin-1和Bcl-2蛋白的表达

免疫组化检测结果显示，Beclin-1在NSCLC中的高表达率显著低于癌旁组织（31.7%比49.2%）（χ2=7.63，P<0.01）；而Bcl-2在NSCLC组织中的高表达率则显著高于癌旁组织（χ2=15.67，P<0.01）（见表1及图1、2）。

二、Beclin-1及Bcl-2蛋白在NSCLC组织中的表达情况与患者临床病理特征间的关系

采用免疫组化检测NSCLC患者组织中Beclin-1及Bcl-2蛋白的表达水平，将其分为高表达和低表达组。

表1 Beclin-1及Bcl-2在NSCLC组织及癌旁组织中的表达

图1 Beclin-1及Bcl-2在NSCLC组织中的表达（SP，×200）

图2 肿瘤及癌旁组织中Beclin-1和Bcl-2免疫组化评分散点图

进一步研究其与患者临床病理特征间的关系。31.7%（38/120）的NSCLC患者肿瘤组织中Beclin-1蛋白呈高表达。Beclin-1蛋白的低表达与NSCLC患者肿瘤细胞分化程度差、病理分期高及淋巴结转移相关（P<0.05）。45.8%（55/120）的NSCLC患者肿瘤组织中Bcl-2蛋白呈高表达。Bcl-2蛋白高表达与NSCLC患者肿瘤细胞分化程度差及淋巴结存在肿瘤转移有关（P<0.05）。但Beclin-1和Bcl-2表达与NSCLC患者的年龄、性别、吸烟、术前血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平及病理类型间均无关（P>0.05）（见表2、3）。

表2 Beclin-1在NSCLC组织中的表达及其临床病理特征[n（%）]

三、Beclin-1、Bcl-2蛋白的表达及临床病理特征与NSCLC患者预后间的关系

单因素Cox比例风险回归分析结果显示，肿瘤分化程度越差、病理分期越高及Beclin-1蛋白低表达与NSCLC患者的预后差间显著相关（P<0.01）（见表4）。进一步行多因素Cox比例风险回归模型分析表明，Beclin-1蛋白的低表达可作为NSCLC患者预后差的独立危险因素（Beclin-1低表达与Beclin-1高表达的危险比为4.508，95%置信区间为1.753～11.591，P<0.01）。同时，肿瘤分化程度及病理分期也可作为影响NSCLC患者预后的独立危险因素（P<0.05、P<0.01）（见表5）。而血清CEA在校正了多个变量的关系后，多因素Cox回归分析结果显示，CEA不是预测NSCLC患者预后的独立危险因素（P>0.05）。

四、Beclin-1及Bcl-2蛋白的表达水平与NSCLC患者预后间的关系

NSCLC组织中Beclin-1高表达患者的总生存趋势优于低表达者，但两者差异尚无统计学意义（P>0.05）（见图3A）。为探讨自噬与凋亡的关系，观察凋亡的缺失是否影响自噬相关性预后，本研究进一步行亚组分析。结果发现，在Bcl-2蛋白高表达组中，NSCLC组织中Beclin-1低表达预示着患者预后差，而Beclin-1高表达则预示着患者的预后较好，有较高的5年总生存率，差异有统计学意义（P<0.01）；而在Bcl-2阳性组中，Beclin-1蛋白的表达与NSCLC患者预后间不存在关联（P>0.05）（见图3B）。

表3 Bcl-2在NSCLC中的表达及其临床病理特征

表4 单因素Cox比例风险回归模型评估影响NSCLC患者总生存率的主要因素

表5 多因素Cox回归评估影响NSCLC肺癌患者总生存率的独立危险因素

讨论

肺癌是目前发病率及死亡率最高的恶性肿瘤[6]，其中NSCLC是常见肺癌类型，约占所有肺癌患者的85%[7]。肺癌已成为占据全世界癌症特异性死亡首位的肿瘤[8]。

自噬和凋亡作为Ⅰ型和Ⅱ型细胞程序性死亡的机制，与肿瘤进展密切相关，作为调控细胞程序性死亡的2种关键分子Beclin-1和Bcl-2，对其研究有助于揭示自噬和凋亡在NSCLC中的作用。本研究关注Beclin-1与Bcl-2蛋白在NSCLC中的表达，并探讨自噬和凋亡在NSCLC中的生物学行为及其临床意义。

图3 Beclin-1及Bcl-2不同表达状态对NSCLC患者术后生存率的影响

一、Beclin-1蛋白表达与肿瘤病理特征间的关系

Beclin-1作为自噬的特异性标志物之一，其与肿瘤之间的关系一直是研究的热点。近年来的研究表明，Beclin-1蛋白表达在胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、乳腺癌中均下调[9-12]，而在结肠癌中Beclin-1蛋白表达上调[13]。本研究表明，在NSCLC组织中，Beclin-1蛋白的表达下调，这与Zheng等[14]的研究结果一致，可见Beclin-1蛋白的调控可能在NSCLC发展中发挥一定作用。

Beclin-1蛋白的表达与肿瘤患者临床病理特征间的关系在不同肿瘤中有不同的表现。在原发性肝细胞肝癌中，Beclin-1蛋白的低表达与患者肿瘤细胞的分化程度、病理分期有关，并预示着总生存情况较差[15]。而在结肠癌中，纳入6项研究的荟萃分析表明Beclin-1蛋白的高表达与肿瘤转移有关，并预示着患者存在较差的总生存[16]。本研究显示，31.7%（38/120）的NSCLC患者肿瘤组织中Beclin-1呈高表达，而68.3%（82/120）的NSCLC患者肿瘤组织中Beclin-1呈低表达。与癌旁组织相比，Beclin-1蛋白在NSCLC组织中的高表达率显著低于癌旁组织（χ2=7.63，P<0.01）。进一步行临床病理特征分析表明，Beclin-1蛋白的低表达与NSCLC患者肿瘤细胞的分化程度差、病理分期高及淋巴转移有关（P<0.05）。多因素Cox风险比例回归分析结果显示，Beclin-1蛋白的低表达可作为NSCLC患者预后差的独立危险因素。

二、Bcl-2蛋白在肿瘤中的表达

Bcl-2蛋白是一种抗凋亡蛋白，由于其有助于抑制细胞凋亡，因此被认定为是一种致癌蛋白[17]，而在动物模型实验中，Bcl-2蛋白的致癌作用也得到了证实[18]。然而，在某些实体肿瘤中，Bcl-2蛋白似乎具有抑制肿瘤的作用，其表达与良好的预后特征相关。包含17项研究、共计5 892例乳腺癌患者的荟萃分析，研究了Bcl-2表达对乳腺癌预后的影响，结果表明其与患者的无病生存期及总体生存期相关[19]。目前对于Bcl-2蛋白发挥保护作用的机制尚不清楚。本研究证实，与癌旁组织相比，Bcl-2蛋白在NSCLC组织中的高表达率显著升高（P<0.01）。Bcl-2蛋白高表达与NSCLC患者的肿瘤细胞分化程度及淋巴转移状态有关（P<0.05），然而多因素Cox风险比例回归分析显示，Bcl-2蛋白的高表达并不能作为NSCLC患者预后差的独立危险因素。因此，从本研究结果看来，Bcl-2蛋白不能作为判断NSCLC患者预后的独立预测因子，当然这仍需更大样本量及后续更多研究的证实。

三、Beclin-1、Bcl-2蛋白与自噬

Beclin-1和Bcl-蛋白2是2种程序性细胞死亡通路的主要因子。自吞噬与凋亡的关系比较复杂，且随细胞类型和应激阶段而变化。自噬可能根据细胞的环境和刺激来启动或抑制凋亡，抑制自噬可能增加细胞对凋亡信号的敏感性[20]。可见，自噬与凋亡的协调可能在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。本研究采用免疫组化染色对NSCLC组织中Bcl-2和Beclin-1蛋白的联合表达进行了生存率评估。本研究发现在Bcl-2高表达组中，NSCLC组织中Beclin-1蛋白低表达预示着患者预后差，而Beclin-1蛋白高表达则预示着患者的预后较好,两者间差异有统计学意义（P<0.01）；而在在Bcl-2低表达组中，Beclin-1蛋白的表达变化与NSCLC患者的预后间不存在关联（P>0.05）。因此，NSCLC患者的预后仅与Bcl-2高表达状态下的Beclin-1表达密切相关。本研究认为，无论自噬的功能状态如何，肿瘤细胞都可以通过凋亡被消灭，而自噬性程序性细胞死亡可能发生在凋亡受到抑制时，而当凋亡被激活的情况下，自噬可能主要起到保护肿瘤细胞免受凋亡的作用，即此时自噬主要发挥保护肿瘤细胞的作用，成为保护性自噬的角色。当然NSCLC发生、发展中的调控机制复杂，可能存在一些独立于凋亡或自噬，或独立于Bcl-2和Beclin-1调控的替代通路，这也有待于后续的进一步研究证实。

总之，本研究发现NSCLC组织中的自噬活性下降，Beclin-1低表达而Bcl-2高表达，二者均与NSCLC的进展有关。Beclin-1可作为Bcl-2高表达NSCLC患者的独立预后标志物。