我国东北部分地区牛溶血性曼氏杆菌的分子流行病学研究

姜志刚，李奕欣，于 力

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 牛羊传染病研究创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069）

溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，Mh）旧称溶血性巴氏杆菌，是一种能够引起牛、绵羊以及山羊等反刍动物发生呼吸道疾病的革兰氏阴性小杆菌。该菌一般寄生于动物的上呼吸道，具有典型的条件致病特征，当机体受到应激刺激时侵入肺脏，可引起严重的纤维素性肺炎或胸膜肺炎[1]。Mh共 分12 个 血 清 型，包 括A1、A2、A5～A9、A12～A14、A16 和A17，其中牛源分离株主要为A1、A2和A6 型[2-4]。

牛呼吸道综合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）是多种病毒和细菌协同或混合感染所引起的运输热、肺炎、支气管炎等病症的统称，其在牛群中呈现高发病率和死亡率，对全球养牛业的危害严重[5-6]。国外研究已表明，Mh 是BRDC 最重要的细菌性病原之一，而由Mh 感染引起的肺炎是BRDC 的主要致死性因素[7-8]。2008 年以来，本研究团队已经对BRDC 另一个重要的细菌性病原荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）的流行病学、致病性以及疫苗进行了系统性研究[9-11]。Mh 与Pm 均是寄生于牛上呼吸道的重要病原，二者均属于巴氏杆菌科，引起的疾病统称为肺炎性巴氏杆 菌 病（Pneumonic pasteurellosis）[12]。本 研 究 团 队2014 年以来的研究表明病牛呼吸道样品中具有较高的Mh 检出率，所以认为Mh 在我国牛群BRDC 的发生与流行中也具有重要的致病作用。

近年来我国陆续有一些关于牛Mh 分离鉴定的报道，但在流行病学方面还缺少系统研究。本研究对2014 年～2019 年间东北部分地区采集的牛呼吸道疾病样品进行Mh 检测、菌株分离，并基于16S rDNA 以及主要毒力基因lktA 对Mh 分离株进行遗传进化分析，研究结果将对了解我国牛Mh 的流行情况提供科学数据，进而对该病原引起牛肺炎提供参考依据，为牛群中BRDC 的防控奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源119 份样品为2014 年～2019 年采集自东北部分地区哈尔滨、齐齐哈尔、白城、黑河、绥化和扎兰屯等地区的大型养牛场牛的鼻拭子和肺脏，其中鼻拭子采自表观健康牛和表现呼吸道疾病症状的牛，肺脏采自因纤维素性肺炎或胸膜肺炎而死亡的牛。

1.2 主要实验材料绵羊血平板培养基购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；脑心浸液（BHI）干粉培养基购自北京奥博星生物技术有限公司；MiniBest 细菌基因组提取试剂盒、DNA Ladder 2000 和PrimeSTAR HS DNA 聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；Axygen 凝胶回收试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司。

1.3 样品DNA 提取和Mh 的检测将采集的鼻拭子用PBS 缓冲液浸泡并用漩涡振荡器震荡混匀，同时将采集的肺脏样品剪碎匀浆，加入PBS 震荡混匀。分别取350 μL 的鼻拭子悬液和肺脏悬液，用Mini-Best 细菌基因组提取试剂盒进行DNA 提取。参照文献[13]中的PCR 方法，对1.3 中提取的基因组DNA 进行PCR 检测，对检测结果进行分析。

1.4 细菌分离鉴定与分型将1.3 中制备的鼻拭子和肺脏PBS悬液分别涂布于绵羊血平板培养基，37 ℃培养20 h，挑取灰色水滴样并伴有β溶血环的菌落置于BHI 培养基中，37 ℃100 r/min 振荡培养20 h 后取350 μL 培养物用MiniBest 细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA。参照文献[13]中的曼氏杆菌属多重PCR 方法以及文献[14]中的Mh分型PCR方法，以提取的基因组DNA 为模板对分离株进行Mh 鉴定及血清分型。

1.5 分离菌16S rDNA 和lktA 基因的PCR 扩增及序列分析参照文献[15]中的细菌16S rDNA 扩增方法以及文献[16]中的lktA 基因扩增方法分别PCR 扩增Mh 分离株的16S rDNA 和lktA 基因，采用Axygen 凝胶回收试剂盒对扩增的片段回收后，由吉林省库美生物科技有限公司进行序列测定。参照GenBank 中的参考序列，对序列测定结果进行分析，采用MEGA 6.0 软 件 中 的Maximum Likelihood 方 法，分 别构建16S rDNA 和lktA 基因的系统进化树。

2 结 果

2.1 Mh 病原检测与分离结果鼻拭子和肺脏样品经处理后，利用Mh 特异性PCR 方法进行分子鉴定，结果如表1 所示，样品的Mh 总检出率为23.5%（28/119）；其中鼻拭子样品的Mh 检出率为0～66.67%，仅2016 年采集的7 份样品中没有检测到阳性，其余年份和地区的样品均能检测到Mh，并从部分阳性样品中分离到Mh；在所检测的5 份因纤维素性肺炎或胸膜肺炎而死亡的牛肺脏样品中，Mh 均为阳性而且均分离出Mh。采用分型PCR 检测，结果显示，分离得到的Mh 分离株分别属于A1、A2 和A6血清型。对检测结果进行统计分析显示，从临床表观健康牛采集的52 份样品中，Mh 的检出率为13.46%（7/52），明显低于从临床患病或死亡牛采集样品的检出率[31.34%（21/67）]。分离株的血清型鉴定结果显示，从健康牛分离的Mh 菌株主要为A2型，占比达80%（4/5）；而从病牛分离的Mh 菌株血清型主要为A1 和A6 型，占比分别为66.67%（6/9）和33.33%（3/9），未分离到A2 型的菌株（表2）。以上结果表明，Mh 在我国牛群中的存在比较普遍，其与我国牛呼吸道疾病，尤其是牛纤维素性肺炎或胸膜肺炎的发生密切相关，对牛致病的Mh 菌株其血清型主要为A1 和A6。

表1 牛溶血性曼氏杆菌的检测及分离Table 1 Detection and isolation of bovine Mannheimia haemolytica

表2 样品检测结果的统计分析Table 2 Statistical analysis of samples detection data

2.2 Mh 分离株16S rDNA 遗传进化分析本研究从收集的样品中共分离获得14 株Mh（表1），通过PCR扩增获得其约1 200 bp 的16S rDNA 基因片段（图1），将这些片段测序后参照GenBank 中具有代表性的11株Mh 和1 株 与Mh 同 属 的Mannheimia glucosida 的16S rDNA 序列，构建系统进化树。结果显示，所有A1 和A6 型Mh 分离株高度同源，与GenBank 中的A1和A6 型菌株位于同一进化分支，且序列同源性为100%；而4 个A2 型分离株与GenBank 中的A2 型菌株位于另一分支，这些菌株与A1 和A6 型菌株16S rDNA 的 序 列 同 源 性 为99.8%～99.9%；Mannheimia glucosida 参考株则单独位于一个分支（图2）。表明，在3 种血清型的分离株中，A1 和A6 型菌株的亲缘关系较近，但这两个型的菌株与A2 型菌株存在一定的进化差异。

图1 分离株16S rDNA 的PCR 扩增Fig.1 Amplification of 16S rDNA in isolates by PCR

图2 基于16S rDNA 的Mh 遗传进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Mh based on 16S rDNA sequences

2.3 Mh 分离株lktA 基因遗传进化分析对14 个Mh分离株的lktA 基因进行PCR 扩增，均获得全长为2 862 bp 的lktA 全长基因（图3），对这些基因测序后，参照GenBank 中具有代表性的14 株Mh 和1 株Mh 同属成员Mannheimia glucosida 的lktA 序列，构建系统进化树。Davies 等将曼氏杆菌属成员携带的LktA 基因序列的同源性与变异特征分为10 个等位基因亚型（lktA1～lktA10）[16]，其中Mh 共包含8 个等位基因亚型，分别为lktA1～lktA3 和lktA6～lktA10。进化分析结果如图4 所示，所有分离株分成3 个分支，其中A1 和A6 型分离株位于lktA1 分支，它们的lktA 基因非常保守、序列同源性为100%；而4 个A2 型分离株的lktA基因表现出一定的序列多样性特征，同源性93.2%～100%，在进化树中属于两个分支，其中分离株HRB1902 和HRB1913 位于lkAt8 分支，而分离株HRB1403 和HRB1413 则位于lktA2 分支；而A2 型分离株与A1 和A6 型菌株的进化距离相对较远，lktA 基因序列同源性仅为85.8%～86.7%。lktA 作为溶血性曼氏杆菌最重要的毒力基因，其进化分析结果表明，在菌株的致病性上，A1 和A6 型菌株具有一定的相似性，而A2型菌株可能与它们存在较大的差异。

图3 分离株lktA 基因的PCR 扩增Fig.3 Amplification of lktA gene in isolates by PCR

3 讨 论

感染Mh 的牛在临床上主要表现流涕、气喘和咳嗽等呼吸道症状，并伴有发热、精神不振和食欲减退等症状，严重病例可出现急性呼吸衰竭导致死亡，剖检可见典型的纤维素性肺炎或胸膜肺炎[3-4,17]。在2014年～2019 年本研究团队选择具有上述症状的牛群采集鼻拭子和肺脏样品，同时考虑到Mh 是条件致病菌，选取了部分健康牛采集样品，一并进行Mh 的检测、分离和定型，并分析分离株间的进化关系。结果显示，从健康牛和病牛样品中均能检测到Mh，但从健康牛的检出率显著低于发病牛的检出率，尤其是在所检测的肺脏典型病变样品中，Mh的检出率和分离率均为100%，这与国外报道的Mh是牛纤维素性肺炎或胸膜肺炎的病原体相符合[17]，表明该细菌对我国牛的呼吸道系统也具有严重的致病作用。此外，研究表明，Mh 对动物的致病性与血清型密切相关：A1 型是牛的最主要致病血清型，在病变组织的分离率可占到所有血清型的70%左右；其次的致病血清型为A6 型；而从健康牛往往分离到的是A2 型[3-4]。本研究分离的14 株Mh 均属于这3 个血清型，而且在所有发病样品中仅分离到A1和A6 两个血清型菌株、没有A2 型被分离，而健康牛样品中仅分离到1 株A6 型菌株、其余4 株均为A2型，可见A1 和A6 两个致病性血清型在我国牛群中均有存在，这种不同血清型致病性差异的内在机制，至今还不清楚。有研究表明，A2型Mh在健康牛的上呼吸道是优势血清型菌株，当机体受到环境应激或其他病原感染等因素刺激时，A1型Mh可有选择性的大量增殖，进而导致牛肺炎的形成[17]。虽然国外也有报道从牛体内分离到A4、A5、A9等血清型的菌株[3-4]，但本研究并未发现。需要指出的是，由于样品采集、冷链长途运输以及检测时效性的限制，本研究采样数量和地区范围比较有限，仅限于东北部分地区的一些大型饲养场，但从流调中获得的细菌致病性与血清型的相关性信息，与国外报道基本相符，结果呈现出同样的规律性。当然，要全面掌握我国牛群Mh 的流行情况，还需进一步扩大病原流调的范围。

图4 基于lktA 基因的Mh 遗传进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Mh based on lktA gene sequences

从细菌16S rDNA 以及lktA 基因的进化分析可以看出，A1 和A6 型菌株的亲缘关系非常近，两个基因在各菌株间的序列同源性均达到100%；在致病性方面，它们均能够从牛肺炎样品中获得分离，甚至有学者认为，A1 和A6 型菌株几乎占据了所有牛曼氏杆菌肺炎分离菌的血清型[16]；而且，从健康牛分离的A2 型菌株在16S rDNA 和lktA 的进化树结构中均与A1 和A6 型菌株的存在一定的进化距离，序列同源性分别为99.8%～99.9%和85.8%～86.7%，表明菌株的亲缘关系与其致病性具有一定的相关性。虽然A2 型菌株对牛致病作用不明显，但有研究显示该血清型是引起羊曼氏杆菌肺炎的主要致病血清型[16]，因此A2 型菌株的毒力与其宿主特异性可能是其具有独立进化分支的原因。前期研究已经表明，lktA 基因具有明显的序列多样性，不同的等位基因亚型与细菌的毒力以及宿主特异性具有相关性，其中牛源A1和A6 型菌株均属于lktA1 亚型，牛源A2 型菌株属于lktA2、lktA3 和lktA10 亚型[16]。本研究中对A1 和A6型分离株的分析结果与上述报道一致，但A2 型分离株分属于lktA2 和lktA8 分支，而前期研究中显示仅羊源A2 型菌株才属于lktA8 亚型[16]。分析可能是不同亚型菌株间基因水平转移或者基因内重组所造成的，也是造成lktA 基因多样性的原因，提示牛源A2 型菌株可能存在更加丰富的lktA 亚型。

Mh 作为BRDC 重要的细菌性病原，其引起的纤维素性肺炎及胸膜肺炎是严重危害全球养牛业的重要疾病。在国内，与Pm 一样，Mh 也已经成为对牛群具有严重威胁的呼吸道病原菌，应引起重视。本研究结果将有助于了解该病原在我国牛群中的流行情况及其危害，为开展病原学、诊断以及疫苗研发等相关研究提供科学依据，同时为建立BRDC 防控技术体系奠定理论和实验基础。