基于cox3 基因分析蛇源裂头蚴种系发育关系

谢雯琴，唐 伟，胡 丹，杨凌宸*，刘 伟*

（1. 永州职业技术学院，湖南 永州 425100；2. 湖南农业大学 动物医学院，湖南 长沙 410128）

裂头蚴（Sparganum）为欧洲刺猬迭宫绦虫（Spirometra erinaceieuropaei）或曼氏迭宫绦虫（Spirometra mansoni）中绦期幼虫的同种异名，是一种重要的人畜共患寄生虫[1]。裂头蚴寄生于蛇、蛙等中间宿主皮下、肌肉等部位，同时在人的眼、皮下、内脏和生殖系统等部位也可寄生[2-3]。终末宿主（如犬、狐狸）吞食感染裂头蚴的中间宿主（如蛙、蛇等）后，裂头蚴可寄生于终末宿主小肠，继而发育为猬迭宫绦虫。裂头蚴病在全世界分布较为广泛，不仅给相关养殖业造成一定经济损失，同时对人类公共健康造成重大威胁。

寄生虫学研究的前提与基础是对寄生虫进行准确的分类鉴定，而寄生虫的形态学鉴定在生物种群的不断进化和发展的前提下显示出了其局限性，从形态上难以对相似种或近缘种进行准确区分，而分子分类学方法（如PCR 技术）可以弥补形态学鉴定方法的缺陷[4-6]。本研究利用PCR 技术对湖南省不同地区蛇源裂头蚴线粒体cox3 基因部分序列进行扩增、测序，并通过对序列的分析初步明确蛇源裂头蚴遗传变异情况及其与其它绦虫的遗传进化关系，为蛇源裂头蚴的分子流行病学和群体遗传研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 裂头蚴样品来源本研究的8 株裂头蚴样品分离自野生大王蛇，采集自湖南耒阳（LY）、湘潭（XT）、长沙（CS）、益阳（YiY）、湘乡（XX）、岳阳（YuY）、株洲（ZZ）、邵阳（SY）共8 个地区。按照常规操作从皮下或肌肉中采集裂头蚴，根据虫株形态学特征鉴定为猬迭宫绦虫裂头蚴[7]，用生理盐水将虫株冲洗、编号，70%酒精保存于-20 ℃。

1.2 主要试剂组织DNA 提取试剂盒等耗材购自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker、PCR 试剂均购自TaKaRa 公司；蛋白酶K 购自Merck公司；引物由湖南擎科生物有限公司合成。

1.3cox3基因的PCR 扩增从70%的酒精保存液中取出单个虫体，用双蒸水反复吹打冲洗2 次后，再用纯净水反复冲洗2～3 次，置于一新的离心管中，在纯净水中浸泡20 min，吸干水分。利用基因组DNA 提取试剂盒分别提取8 株裂头蚴的基因组，采用文献[8]中cox3基因引物进行PCR扩增，上游引 物Secox3-F： 5'-TGCATTTTGGTTATTCTTAG-3'/下游引物Secox3-R：5'-ACGATAGGCCCCGGCTGAA G-3'。PCR 扩 增 条 件 为：94 ℃5 min；94 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃1 min，共36 个循环；72 ℃5 min。PCR产物回收纯化后由上海华大基因有限公司测序。

1.4cox3基因的序列分析利用DNAstar 5.0 软件对cox3 基因进行序列分析，并与GenBank 中同种裂头蚴和其它种绦虫cox3 基因序列进行种内及种间比对。利用Megan 5.0 软件采用NJ 法（Neighbor-Joining，邻接法）绘制cox3 基因的种系进化树。

2 结果与讨论

2.1 分离虫株样品PCR 扩增结果对湖南省8 株裂头蚴均扩增出约350 bp 的cox3 基因部分序列，与预期目的片段长度相符（图1），表明正确扩增了裂头蚴的cox3 基因。

近几年来，PCR 技术在寄生虫分子分类学和分子遗传学等方面的研究应用广泛[9-12]，其中线粒体cox3 基因序列被广泛用于研究多种寄生虫包括蛔虫、猬迭宫绦虫等种内和种间遗传变异的分析[10-12]。

2.2 分离株cox3基因测序与序列分析结果测序结果显示湖南部分地区8 个分离株cox3 基因部分序列大小一致，均为342 bp，A+T 碱基含量（65.13%～66.37%）明显高于C+G 碱基含量（33.63%～34.87%）。核苷酸同源性分析结果显示，8 个分离株cox3 基因序列之间的同源性为98.2%～100.0%，种内差异性为0～1.8%，其差异主要是以碱基互换为主；与GenBank登录的蛙源猬迭宫绦虫裂头蚴同源性为98.9%～99.4%，与蛇源猬迭宫绦虫裂头蚴同源性为97.6%～98.2%，与其它科绦虫的同源性为63.4%～73.9%，种间差异为26.1%～36.6%。结果表明蛇源裂头蚴cox3基因序列种内差异较种间差异小。

本研究采用PCR 技术，首次对湖南省部分地区蛇源裂头蚴线粒体cox3 基因部分序列进行扩增、测序并对序列进行分析，初步明确湖南省部分蛇源裂头蚴遗传变异情况及其与其它绦虫遗传进化关系。

2.3cox3基因序列系统发育树的构建和分析利用Mega5.0 软件中的NJ 法构建基于线粒体cox3 基因序列的种系发育树，分析蛇源裂头蚴与其它绦虫的遗传进化关系。结果显示，8 株分离的裂头蚴，与GenBank 登录的不同宿主的猬迭宫绦虫位于同一分支，但与其它绦虫如裂头绦虫（Diphyllobothrium nihonkaiense，EF420138.1）、犬复孔绦虫（Dipylidium caninum，AB732959.1）、犬复殖孔绦虫（Diplogonoporus grandis，AB425840.1）、细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，MK774655.1）和带状绦虫（Taenia solium，AF367053.1） 所属分支相隔较远（图2）。结果表明，cox3 序列种间差异较大，种内相对保守。

图2 基于线粒体cox3 基因构建的蛇源裂头蚴系统进化树Fig.2 Phylogenetic analysis of cox3 gene sequences from the snake Sparganum

本研究结果表明线粒体cox3 基因可以用于研究蛇源裂头蚴种系遗传变异的分子标记，为蛇源裂头蚴的分子流行病学和群体遗传研究奠定基础。